實驗室操作手冊（性病分冊）生殖器標本取材方法及注意事項男性標本:(1)如疑為急性淋病奈瑟菌或其他化膿性細菌感染應在清洗龜頭部后,以碘伏或其它非粘膜刺激性消毒后,擠出分泌物立即以無菌棉拭子采取,立即送檢，或以專用的細拭子插入尿道口1—2cm,旋轉采取?⑵如疑為前列腺炎、精囊炎慢性淋病奈瑟菌感染應由醫(yī)師按摩前列腺,以無菌手續(xù)自尿道口采取前列腺液送檢.女性標本:(1)成年婦女自宮頸采取標本，應在擴陰器的支下,選取有炎癥或分泌物部位,先以無菌棉拭子拭去表淺層分泌物,再用另一拭子取分泌物送檢.如做厭氧或真菌培養(yǎng)應另外采取標本.如未成年幼女疑患性傳播疾病時,不應使用擴陰器,應以無菌拭子在陰道口處采取分泌物送檢.對不合格標本的處理申請單項目與標本不符.申請單姓名、科別、床號和標本的檔簽不符.標本已有明顯的污染跡象(如開塞).送檢標本不符合上述取材要求..標本過少或已明顯干燥.申請單項目的項目填寫不符合要求或無醫(yī)師簽字.送檢標本的時間已明顯拖延.當標本符合以上任何一條都作為不合格樣本,必須重新采取樣品且核對標本無誤后才可以進行下一步實驗.淋病的涂片檢查〖原理〗急性淋菌性尿道炎病人常有大量黃色分泌物,在有些膿細胞內可有許多淋球菌,淋球菌革蘭染色革蘭陰性雙球茵.檢查分泌物涂片中有無典型細胞內革蘭陰性雙球茵,可作初步診斷淋病的依據(jù).〖試劑〗采用自配革蘭氏染液,試劑見試劑配制附錄.方法〗1-取材:男性:拭子蘸取無菌生理鹽水，插入尿道2-3cm,輕輕轉動，停留數(shù)女性:宮頸拭子蘸取無菌生理鹽水先將宮頸口的分泌物擦去,拭子插入宮頸內政T.5cm,轉動并停留駕齊驅20-30秒，取出涂片.涂片后,待自然干燥后火焰固定,革蘭染色,油鏡鏡檢.〖結果〗部分白細胞的胞漿中有圓形或卵圓形、成雙排列的革蘭陰性雙球茵,兩茵接觸面扁平或稍凹，茵體大小可有差異?菌體長約0.7um,寬約0.5um〖注意事項〗涂片時不要太用力，輕輕滾動，以免炎癥細胞漿內淋球菌因細胞破壞而溢出細胞.涂片厚薄適宜?脫色時間應以涂片的厚薄而定，過厚而脫色清足時，革蘭氏陰性誤染成陽性.固定涂片時，只要將涂片迅速通過火焰二三次，避免加熱過度使細胞變形.報告結果時應注明細胞或細胞外發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性雙球菌.〖臨床意義〗細胞內革蘭氏陰性雙球菌為淋病患者的診斷標準.男性淋菌性尿道炎檢出敏感性和特異性在95%以上，具有初步診斷的價值，但女性患者由于其它雜菌的影響，檢出敏感性僅50%，且特異性較差，故世界衛(wèi)生組織不推薦將涂片法用于女性淋病患者的診斷.同時也不推薦用于診斷淋菌性直腸和咽部感染.衣原體C—C快速免疫測定法〖原理〗本試驗是將衣原體單克隆抗體的帶色乳膠復合物吸附于濾紙上，將濾紙夾在二塊塑料板中間.若加入的標本為陽性，則標本中的抗原與結合有乳膠的單抗結合，復合物因毛細作用向前擴散移動至結果窗，可被該處含有的未標記的鼠抗衣原體單抗所捕捉，在結果窗中出現(xiàn)一條黑線，標本即為陽性，過剩的未結合的帶色乳膠標記的鼠抗衣原體單抗可移到質控窗，與該處的兔抗鼠抗體結合，顯現(xiàn)一條黑線.〖試劑〗本試驗采用立明試劑盒.試劑名稱為:快速沙眼衣原體膠體金測定〖方法〗將試劑、反應板和塑料管自冰箱取出置室溫度30分鐘.2?加試劑1至塑料管刻度(0.6ml),將取材拭子放入管內，攪混80+2°C水浴10分鐘—12分鐘,使細胞中衣原體的脂多糖釋放出來.取出后,沿管壁轉動擠壓拭子并丟之,加蓋后放室溫中5分鐘冷卻.將測拭板平放,加5滴提取液于檢測窗,靜置15分鐘—30分鐘后觀察結果.陽性對照試驗:取試劑2加5滴于塑料管,再加試劑1至刻度,以下操作按3、4進行,結果應出現(xiàn)陽性反應.結果〗應另取測試板進標本為陽性時,結果窗中顯示一條黑色線.強陽性者黑線色深,出現(xiàn)時間快,出現(xiàn)隱約可見的黑線也判為陽性.8520/質控窗顯示一條黑線,表示標本試劑質量可靠,試驗正確.如30分鐘內,未見黑線出現(xiàn),應另取測試板進行試驗.臨床意義〗作衣原體診斷的參考.結果陽性表示病人可能有衣原體感染,但需要結合臨床癥狀全面考慮.注意事項》標本中需要一定量抗原,提取的抗原低于試驗敏感性時可出現(xiàn)假陰性,因此,每批試驗應同時用陽性對照標本測試,并在質控窗和結果窗均出現(xiàn)一條黑線.如本試驗陰性而病人持續(xù)有癥狀則應作衣原體培養(yǎng).本試驗檢測的是衣原體抗原,因而不能區(qū)別是衣原體的感染還是攜帶者,也不能區(qū)別衣原體的死活,不能作判愈試驗.不要混合不同的試劑和用具,不要蓋錯瓶蓋.試劑中含有疊氮化鈉,它與鋁、銅等金屬可起反應引起爆炸,應避免接觸此類金屬器具,處理時可用大量水沖洗,衣原體可多途徑感染,處理標本時要戴手套,不要在實驗室吃東西,喝水和抽煙.支原體液體分離培養(yǎng)和鑒定法〖原理〗解脲支原體(Uu)具有尿素酶，能分解尿素產(chǎn)氨，使含酚紅指示劑Uu液體培養(yǎng)基pH值升高變堿性，液體顏色由黃變紅，人型支原體(Mh)具有精氨酸酶，能分解精氨酸產(chǎn)氨，使分解精氨酸產(chǎn)氨，使含酚紅指示劑的Mh液體培養(yǎng)基pH值升高變,液體顏色由黃變紅.〖試劑〗本實驗采用中山市天洋電子生物傳感器有限公司生產(chǎn)的試劑盒.名稱為:Uu和Mh的分離和鑒定液體培養(yǎng)基.〖方法〗1?標本采集：男性:用棉拭子取尿道內口2—2.5cm處分泌物、前列腺或中段尿沉渣（中段尿10ml2000T/min離心10分鐘）.女性:取宮頸管內口1—2cm處單層柱狀上皮細胞，取樣拭子不可碰陰道壁,尿液不推薦.接種:將標本洗入單一Uu或Mh液體培養(yǎng)基，或用濾菌器過濾接種.掊養(yǎng):置37°C恒溫箱孵育1-3天,每日觀察培養(yǎng)基顏色變化.結果〗液體培養(yǎng)基變紅色，并清流澈可初步判斷為Uu或Mh陽性.注意事項〗取材要準確，尤其女性宮頸拭子，要盡量多取標本.采樣時旋轉拭子30秒以上，取含柱狀上皮細胞的樣品.抽出拭子進避免與陰道壁接觸.取材后應盡快接種，如果不能及時接種，應將標本放入1ml運送保存液中冰箱保存，4C易失去活力，超過48小時應放-70C冰箱保存.若是細菌污染致液體顏色變化，應及時過濾（濾膜孔徑0.45um）后再培養(yǎng)觀察是否有顏色變化或轉種固體培養(yǎng)基掊養(yǎng)，陰性結果應繼續(xù)觀察至第5天.〖臨床意義〗支原體培養(yǎng)陽性，說明有支原體感染，如果患者有臨床癥狀，但其它病原體檢查陰性，則應考慮支原體引起致病的可能，在部份正常人群中也可存在支原體.線索細胞檢查---濕片法/干片法原理】細菌性陰道炎時陰道正常菌群發(fā)生變化，乳酸桿菌減少或消失，而陰道加特納菌，厭氧菌等過度生長。此外，加特納菌和厭氧菌吸附在陰道鱗狀上皮細胞表面，使細胞邊緣模糊不清呈鋸齒狀，形成有特殊外觀的線索細胞。對陰道分泌物作濕片和涂片革蘭染色，在顯微鏡下可觀察線索細胞的有無和百分比多少，以及陰道菌群的變化情況。試劑】本實驗采用自配革蘭氏染色液，試劑見試劑配制附錄。【方法】1．濕片法：在載玻片上加一滴生理鹽水，將陰道分泌物與生理鹽水混合成懸液，加上蓋玻片后，在高倍（400倍）鏡下檢查。2．干片法：取陰道分泌物，涂片，作革蘭染色，油鏡下檢查?！窘Y果】線索細胞為陰道鱗狀上皮細胞的表面覆蓋著許多球桿菌（主要是加特納菌，有時合并有厭氧菌，革蘭染色不穩(wěn)定），使細胞呈斑點狀、顆粒狀外觀，細胞邊緣模糊不清呈鋸齒狀?！九R床意義】當線索細胞占全部上皮細胞的20%R以上時一般認為可診斷BV。濕片法診斷BV的敏感性在80%以上，特異性在90%以上。革蘭染色鏡檢觀察陰道上皮細胞中線索細胞的敏感性和特異性高于濕片法，分別為89%和93%。陰道毛滴蟲顯微鐿形態(tài)學檢查---濕片法原理】陰道毛滴蟲運動活潑,具有旋轉式的特有方式.等滲鹽水可保持陰道毛滴蟲維持寄生于宿主時的形態(tài)和運動狀態(tài).直接鏡檢.試劑】本實驗采用等滲鹽水.方法】將采集標的拭子放入含有少量等滲鹽水的試管內,混勻后吸取一滴于載玻片上或將采集標本的拭子直接在滴有鹽水的載玻片上?尿液需2000r/m離心15分鐘,離心后取沉渣一滴于載玻片上.蓋上蓋玻片,于10X/10X顯微鏡下觀察.【結果】等滲鹽水濕片中若有陰道毛滴蟲,則鐿下可見梨形或水滴狀,無色透明或淡藍色蟲體,大小約10-30umX5-15um,稍大于白細胞.蟲體借助于鞭毛和波動膜作螺旋式跳動，運動活潑.有時可見到保護形的滋養(yǎng)體，其形態(tài)為外圍細胞質增厚，細胞質呈均勻、光潤、透明?！咀⒁馐马棥颗匀〔臅r所用窺陰器,只能用少量無菌等鹽水濕潤.不可用潤滑劑,因為一些潤滑劑對陰道毛滴蟲的活有形影響.從取材到觀察的時間間隔越短越好,否則易影響滴蟲的活動性或蟲體受到破壞使檢查結果受到影響.注意標本的保溫,尤其冬季氣溫較低,影響陰道毛滴蟲的活力.【臨床意義】滴蟲檢查陽性,結合臨床表現(xiàn),即可做出初步診斷,應及時治療.此法簡便、快速，是門診的常規(guī)檢查方法。陰道毛滴蟲顯微鏡形態(tài)學檢查---涂片染色法原理】分泌物涂片作染色檢查，可以清楚地看到蟲體形態(tài)和內部結構，還能觀察到陰道的微生物相、清潔度和細胞組織相。試劑】本實驗采用自配革蘭氏染色液，試劑見試劑配制附錄。方法】3．涂片：將標本加少量生理鹽水涂成薄片，置室溫自然干燥。4．固定：用酒精燈火焰固定或甲醇固定。5．染色：革蘭氏染色6．油鏡觀察結果。【結果】革蘭氏染色時，滴蟲易受涂片時擠壓變形，可呈多形性，如梨形、圓形、長圓形、多角形等，大小差異較大，介于白細胞的2-3倍至鱗狀上皮細胞的1/2之間；蟲體輪廓清楚，胞漿稍呈嗜酸性，疏松泡沫，有紫紅色長圓形細胞核，多在偏心位置，并偶見1-4條鞭毛，而滴蟲的波動膜及軸柱難于著色，不易見?！咀⒁馐马棥客科旧芏喾N因素影響，上述蟲體典型結構并非完全可見。涂片過程、染色過程的擠壓等因素，可造成蟲體大小懸殊，形態(tài)多形性，但是長圓形的細胞核，疏松且有空泡的細胞質，及偶可見到的4根前鞭毛，具有一定的特征性，不難辯認。.【臨床意義】滴蟲檢查陽性,結合臨床表現(xiàn),即可做出初步診斷,有利于鑒定，并可長時間保存和利于教學。念珠菌的直接檢查一．濕片法【原理】10%K0H可保持念珠菌在組織內的形態(tài)，并使菌絲及抱子具淡綠色折光，如觀察到抱子，芽生孢子及假菌絲，即可作為診斷依據(jù)?！驹噭勘緦嶒灢捎米耘?0%KOH液，試劑見試劑配制附錄。【方法】加1滴10%K0H于載玻片上，將采集標本直接涂在KOH溶液中，蓋上蓋玻片，置酒精燈火焰加熱，直接用10X或40X鏡檢。【結果】念珠菌陽性者鏡下可見略帶淡綠色折光的假菌絲和成群的卵圓形孢子，孢子直徑3—5um?假菌絲節(jié)間有明顯的狹窄部，偶可見僅有抱子而無菌絲，可能其它酵母感染，應報告為“芽生孢子陽性”。皮屑直接鏡檢可見菌絲和孢子，報告應寫作“菌絲、孢子陽性”?！咀⒁馐马棥坎杉瘶吮痉椒ㄒ_，標本量要多。念珠菌性陰道炎、龜頭炎的病人，僅有分泌物或偽膜而無鱗屑的病人，可直接用等滲鹽水涂片作檢查，這樣可以直接用玻片上的標本做真菌培養(yǎng)。&念珠菌性龜頭炎的病人，如有鱗屑應滴加10%K0H溶液，促進角質溶解，增加透明度，以利于檢查。二．干片革蘭染色法【原理】分泌物涂片染色后，念珠菌的假菌絲及芽生孢子可染成革蘭氏陽性，更利于檢出，同時還可以觀察有無其它微生物及細胞組織?！驹噭勘緦嶒灢捎米耘涓锾m氏染色液，試劑見試劑配制附錄。【方法】1．本采集方法同10%KOH鏡檢法。2．涂片：將所采集標本加入少量鹽水制成薄片，室溫自然干燥。3．固定：用灑精燈火焰固定。4．革蘭染色，油鏡觀察?！窘Y果】經(jīng)革蘭染色后假菌絲及芽生孢子或孢子均被染成革蘭陽性，假菌絲的狹窄部及孢子的特征明顯，易于觀察?！咀⒁馐马棥扛锾m染色法檢查念珠菌比KOH法、濕片法敏感性高，特異性高，尤其是對生殖器念珠菌的分泌物，嬰幼兒皮膚念珠菌感染的檢查，這些標本見芽生孢子，少見假菌絲，革蘭染色比KOH法更易查到孢子。【臨床意義】涂片顯微鏡檢查的陽性率較其他方法高，但只要檢查陽性即可確診。該法具有準確率高，所需設備簡單，出報告快等特點。但陰性時不能完全排除感染，僅憑鏡檢也不能確定為何種念珠菌感染，需作念珠菌培養(yǎng)鑒定?！驹怼棵范韭菪w侵入人體后，在皮膚黏膜下增殖，并很快沿著淋巴管到達附近淋巴結，經(jīng)過2-4周的潛伏期，在侵入部位發(fā)生炎癥反應稱為硬下疳。數(shù)周后淋巴結腫大。二期梅毒是梅毒螺旋體由局部經(jīng)淋巴結進入血液，主要為皮膚黏膜損害。這些損害均可檢查梅毒螺旋體。用暗視野顯微鏡檢測時，光線從聚光器邊緣斜射到顯微鏡載玻片上的生物體或顆粒上，在黑暗的背景下發(fā)出亮光。方法】1．按常規(guī)方法取標本制成等滲鹽水涂片，加蓋玻片后立即鏡檢。2．在預先調整好的暗視野顯微鏡的聚光器上加數(shù)滴浸油。將標本玻片置載物臺上，上升聚光器使浸油接觸載玻片底面。3．用低倍物鏡(10倍)對焦標本，通過調節(jié)聚光器上的光軸短矯正螺絲，使視野中光環(huán)居中，并通過上下調節(jié)聚光器的高度對焦以便得到最小直徑的光環(huán)。3．特征性形態(tài)和運動方式的梅毒螺體。梅毒螺旋體在暗視野下表現(xiàn)為白色透明發(fā)光體?？梢酝ㄟ^它的典型形態(tài)、大小及運動方式加以識別。它是一種纖細的(0.25-0.3um)微生物，長6-14um,平均8-14個規(guī)則、緊密的螺旋。梅毒螺旋體運動緩慢而有規(guī)律，主要有三種運動方式，即旋轉式、蛇行式和伸縮式?！窘Y果】在暗視野顯微鏡下，如發(fā)現(xiàn)有典型的梅毒螺旋體特征和運動方式為陽性結果?！咀⒁馐马棥?．取材前，應用無菌等滲鹽水清潔皮膚表面。2．取材時應注意無菌操作，并應取到組織滲出液，盡量避免出血，以提高檢出陽性率。3．取材后應立即置暗視野顯微鏡下觀察。4．暗視野顯微鏡觀察要觀察到梅毒螺旋體的特征性形態(tài)和運動才能確定，對口腔潰瘍標本，應注意其它螺旋體的存在。5．暗視野顯微鏡必需經(jīng)過良好培訓具有經(jīng)驗的人員操作，以便正確地使用顯微鏡?！九R床意義】1．當標本陽性時，依據(jù)梅毒螺旋特征性形態(tài)和運動證實螺旋體的存在，在臨床上可確診梅毒，特別是對有皮膚黏膜損害和淋巴結病變的一期、二期梅毒的診斷具有重要價值，且具有快速、方便、易操作等特點。暗視野顯微鏡檢查法已被世界衛(wèi)生組織確定為性病實驗室必備項目之一。2． 當標本陰性時，未能發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體溫表不能排除梅毒的診斷，陰性結果的原因可能有以下幾點：標本中螺旋體數(shù)量不足(單次暗視野檢查的敏感性低于50%)、患者已經(jīng)治療過、皮損已接近自然消退、或不是梅毒皮損。3． 由于口腔中除了密螺旋體外還有其它螺旋菌，因此不能推薦用暗視野顯微鏡檢測取自口腔皮損的材料。4．暗視野顯微鏡是能夠立即在獲得性或先天性梅毒的早期進行直接診斷的唯一方法。因此被推薦用于性病臨床和醫(yī)院的實驗室甲苯胺紅試驗(TRUST)原理〗人體感染梅毒螺旋體后,經(jīng)過一定時間,血清中產(chǎn)生一定的抗類脂質抗原的非特異性反應素,與試劑中加有EDTA、氯化膽堿和磷酸鹽緩沖液的抗原發(fā)生凝集反應.試劑〗本試驗采用上海榮盛生物技術有限公司生產(chǎn)的試劑。試劑名稱為：梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗診斷試劑。方法〗一．定性試驗離心血液,分離血清.2..吸取50ul血清放在白色卡片圈內,并均勻涂布整個圈內.3將TRUST抗原輕輕搖勻，用配套專用針頭吸取抗原，每個標本中加1滴抗

原液。4．將反應板置旋轉器旋轉8分鐘（180±5次/分鐘）,5．立即用肉眼觀察結果.4.結果:強陽性（+++?++++）陽性（++）弱陽性（+）可凝（±）陰性（－）有大的或中等大小的絮狀物,溶液清亮.絮狀物較小,懸液較清亮.絮狀物較小,強陽性（+++?++++）陽性（++）弱陽性（+）可凝（±）陰性（－）二．定量試驗1．在反應板圓圈內加入50ul等滲鹽水（一般做6個滴度）。2．吸取50ul血清加到第一了混勻后，再吸取50ul至第二孔稀釋，依此作倍比稀釋（1：2－1：64），最后所稀釋的圓圈內應棄去50ul。3．每個圓圈加加1滴抗原混勻，旋轉時間和速度，觀察結果同定性。4．記錄出現(xiàn)1＋陽性反應的最高血清稀釋倍數(shù)，即抗體效價?！甲⒁馐马棥皆撛囼灧磻?3—29°C,試劑合在使用前應恢至室溫.用旋轉式搖床，不用平衡式振蕩器。試驗完畢，立即觀察結果。為防假陰性，試驗最好用純血清。初篩試驗陽性者特別是初診者，應做確證試驗以排除生物學假陽性。避免出現(xiàn)“前滯”現(xiàn)象，對可疑者應將血清稀釋后測定。臨床意義〗該法為特異性試驗,簡便易行,具有一定的特異性和敏感性,可作為標本的初篩以作為療效觀察隨訪的指標.杜克雷嗜血桿菌杜克雷嗜血桿菌【原理】