辣椒誘導抗病病研究進展

青椒起源于美國和南美洲。由于其豐富的營養(yǎng)成分以及新鮮的味道，它在世界各地種植很受歡迎。其產量是茄子中的一流蔬菜。辣椒在我國各地均有栽培,并已成為農民致富的重要經濟作物之一。我國辣椒種植面積廣,但由于各地環(huán)境條件相差比較大,辣椒病害種類多且為害嚴重,已成為我國辣椒生產的主要障礙。開發(fā)利用植物抗病性潛能是病蟲害綜合防治的一條潛在途徑。近年來,國內外在辣椒誘導抗病性研究方面取得了不少重要成果,其中有些研究成果已在生產上推廣應用,為辣椒病害的綜合防治開辟了一種新的有效的手段。主要誘抗劑的制備在農作物誘導抗病性研究中,以辣椒為對象的目前還比較少,并且已見報道的只有病毒病、疫病和炭疽病等,所用的誘抗劑也僅僅局限于少數幾種,下面就目前對辣椒誘導抗病性的研究作簡要回顧。1病毒衛(wèi)星rna誘導的未來在接種中的抗性病毒病是危害辣椒生產的嚴重病害。隨著辣椒栽培面積的擴大,病毒病的危害日趨嚴重,流行年份可使椒果減產達10%以上。辣椒病毒病雖一直是育種學家致力解決的重要病害之一,但由于其寄主范圍極廣,又容易發(fā)生突變,故至今仍沒有選育出抗病毒病的辣椒品種,也沒有形成任何能有效控制該病的方法。引起辣椒病毒病的病原有黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草花葉病毒(TMV)和馬鈴薯X病毒(PVX),田間多為混合侵染,即幾種病原同時侵染同一株寄主植物,這種情形比單一病原侵染的防治難度更大。目前利用外源誘抗劑誘導辣椒抗病毒病已經取得了顯著的進步,雖然尚未真正應用到生產上,但已顯示出其廣闊的發(fā)展前景。用TMV的弱突變株系預先在辣椒上接種,誘導辣椒獲得對TMV強毒株系侵染的抗性。如Murata等從TMV弱毒株系C-1421感染的甜椒葉片中提取2%粗提液,噴灑于1～2葉的甜椒幼苗上,結果表明幼苗最初顯示輕微的花葉癥狀,幾天后,癥狀逐漸消失;再接種TMV強毒株系,該預接種的甜椒植株比未經預接種的表現高度抗病性,而且果實上不表現病癥,產量未受影響。然而,在已進行的田間試驗中,這類預接種還沒有獲得成功的報道,因為以TMV弱突變株系預接種的辣椒植株接種強毒株系,其產量雖然比只接種強毒株系的高,但比未經接種的植株卻明顯降低。Tanzi以辣椒花葉病毒進行試驗也獲得了相似的結果:即在溫室內用辣椒花葉病毒的弱毒系M-1誘導辣椒抵御強毒株系pepMV9的侵染時,經此處理的辣椒植株只表現輕微的花葉癥狀,而未經預接種但感染pepMV9的辣椒,卻顯示嚴重的花葉癥狀;從產量上分析,兩者分別是未經接種的對照植株的76.3%和48.8%。病毒衛(wèi)星RNA是依賴于病毒才能復制的一類低分子量RNA,它可以減輕或增強由病毒引起的病害的發(fā)生。1981年田波等首先證明了CMV衛(wèi)星RNA能夠有效地防治由CMV強毒株系引起的嚴重病害。之后,Montasser-MS用一種減輕病害的病毒衛(wèi)星RNA與CMV弱毒株系CMV-S結合作為誘抗劑,預接種于辣椒和甜瓜,然后再用CMV的強毒株系CMV-D和CMV-16挑戰(zhàn)接種,通過四a的溫室和田間試驗證明病毒衛(wèi)星RNA能有效地誘導植株對CMV的強毒株系產生抗病性。但在田間試驗中,也出現了上面提及的現象:即經預接種和挑戰(zhàn)接種的辣椒植株雖比只接種強毒株系的辣椒植株產量高,但比對照植株低,為對照的80%。出現這種現象的原因可能是因為對照植株的生長季節(jié)發(fā)病較晚,產量未受病害的影響或影響較小;而經預接種的植株雖然比只接種強毒株系的植株產量高,但由于其癥狀表現較早,依然影響了植株的產量,導致最終產量低于對照。病毒弱毒株系和病毒衛(wèi)星RNA誘導作物產生的這類抗性,其作用機制可能是由于它們與病毒強毒株系之間存在相同的作用位點或相同的酶系,病毒弱毒株系和病毒衛(wèi)星RNA既預先占據了這些作用位點或酶系,強毒株系的大量表達受到抑制,故起到了抗病作用。也有人認為衛(wèi)星RNA的作用機制是衛(wèi)星RNA與病毒基因組RNA爭奪病毒復制酶。因為衛(wèi)星RNA分子小,分子周期短,隨著復制循環(huán)的增加,衛(wèi)星RNA的復制量遠遠大于基因組RNA的復制量,大量的衛(wèi)星RNA占據復制酶,必然使病毒基因組RNA的復制減少,故預接種植株表現出抗病毒的特性。2自然生物及其誘抗劑對辣椒病的影響辣椒疫病是辣椒生產上另一種毀滅性病害,其發(fā)病迅猛,在流行年份可造成很大損失。多年來,病理學家和育種學家一直致力于研究這種重要病害,并已育出多種抗疫病的辣椒品種。此外,研究表明,一些生物或非生物誘抗劑也表現對辣椒疫病的誘抗效果,可以作為一種輔助手段幫助消滅疫病的發(fā)生。目前已見報道的這種誘抗劑有β-氨基丁酸(BABA)、木霉菌等。2.1baba誘導辣椒植株的抗疫機理β-氨基丁酸(BABA)是一種植物體內次生代謝的非蛋白氨基酸,用它做為誘抗劑處理辣椒,可以誘導辣椒對隨后接種的疫霉菌產生抗性,降低甚至抑制疫病的發(fā)生。例如:Sunwoo-JiYoon等以1000和2000μg/mL的氨基丁酸的三種同分異構體α、β、γ-氨基丁酸(AABA、BABA、GABA)的水溶液噴灑辣椒植株,以清水做對照,4d后挑戰(zhàn)接種疫霉菌。試驗結果顯示GABA與對照病情指數相似,表明其沒有誘抗活性;二種濃度的AABA誘抗效果分別是30%和40%,而BABA在二種濃度的誘抗效果均可達到100%,只是在2000μg/mL時,處于分枝期的辣椒葉片變黃且出現棕色斑點。而在實驗室內的抑菌活性實驗中,1000μg/mL的AABA、BABA、GABA均不能抑制疫霉菌菌絲的生長和游動孢子的萌發(fā)。此外,經BABA處理的植株上接種疫霉菌的壞死病斑,其擴展速度明顯慢于AABA、GABA處理的植株。用1000μg/mL的BABA處理辣椒,1、4、7d后挑戰(zhàn)接種疫霉病,其誘抗效果分別達到47%、85%、100%。這表明BABA的保護效果隨著時間的推移而逐漸增強,這種抗性是由多基因控制的數量抗性,且誘導處理與挑戰(zhàn)接種的時間間隔至少在4d以上。但也有報道認為,間隔時間有3d即可,且抗性可持續(xù)20d以上。Lee-YeonKyeong等在電子顯微鏡下觀察了經BABA誘導處理后挑戰(zhàn)接種疫霉菌的辣椒的組織與超微結構,發(fā)現BABA處理的植株,其隨后侵染的病原菌菌絲生長和孢子形成明顯受到抑制。其中一個很顯著的超微結構特征是BABA處理的植株形成了細胞壁乳突,而病原菌的吸器被包裹在這些又厚又密的乳突中難以發(fā)展,致使侵入植物組織中的病原菌難以進一步入侵;另一個特征是被侵入菌絲的細胞質中,其線粒體結構退化,變得沒有可區(qū)分的雙層膜層和完整的嵴。這些結果表明BABA誘導了辣椒枝干組織超微結構的變化,達到了抑制病菌侵染的目的。關于BABA的誘抗機理,這方面的研究是BABA可誘導辣椒枝干合成β-1.3-葡聚糖酶和幾丁質酶,特別是BABA處理后挑戰(zhàn)接種疫霉菌,枝干上的這兩種酶積累更加顯著,用變性蛋白免疫印跡分析發(fā)現同時有β-1.3-葡聚糖酶和幾丁質酶的幾種同工酶同時出現BABA處理后,β-1.3-葡聚糖酶的同工酶Ga1被誘導和積累,幾丁質酶的兩種同工酶Ga1和Ga3都不積累,但挑戰(zhàn)接種后,幾種酶的積累非常顯著。這些結果似乎表明β-1.3-葡聚糖酶和幾丁質酶這兩類物質可能參與了植株的抗病反應。然而,Mauch等的抑菌活性試驗表明β-1.3-葡聚糖酶和幾丁質酶具有抗鐮孢菌活性而對卵菌無效。眾所周知,疫霉菌屬于卵菌,其細胞壁成分由纖維素而非幾丁質組成;Cohen等在BABA誘導番茄的實驗中發(fā)現β-1.3-葡聚糖酶只在預處理葉片積累,在未經預處理的上部葉片并不增加,因而Cohen等認為β-1.3-葡聚糖酶和幾丁質酶可能與對疫霉的誘導抗性無關。綜合上述觀點,β-1.3-葡聚糖酶和幾丁質酶在誘導辣椒抗疫病中的作用還有待進一步研究證實,但可以肯定的是這二種酶并不是直接抑制疫霉菌的入侵,而可能是通過間接方式參與誘導抗疫病的。辣椒植株單獨接種疫霉菌,水楊酸含量水平是對照的2～4倍,而經BABA預處理后再接種疫霉菌,3d后水楊酸可達到對照的12倍,這些結果表明水楊酸可能是一種重要的內源合成化合物,能活化辣椒植株體內抗疫霉菌的特殊組分和誘導PR蛋白的表達。而在最近對煙草和擬南芥的研究中,已經證實了在導致系統(tǒng)獲得抗性的信號轉導途徑中水楊酸的積累,即表明水楊酸是植株獲得系統(tǒng)抗性過程中的一種重要的信號分子。其在擬南芥中所誘導的信號途徑已經得到了廣泛的認同。還有試驗表明,細菌Pseudominasputida中的nahG基因編碼水楊酸羥化酶(E.C.1.14.13.1)可催化SA轉化為兒茶酚。Gaffney等構建了結構性表達nahG基因的煙草植株,這種轉基因植株積累了大量酶蛋白,即使受病原物誘導接種,其SA積累量也很低,且植株上部未處理葉片不能積累PR-1,不產生SAR,這表明SA是植物產生系統(tǒng)獲得抗性(SAR)所必需的。在擬南芥中,SA誘導表達的PR基因主要是PR-1、PR-2和PR-5;在煙草中,SA誘導表達的主要是酸性PR基因。BABA誘導處理后,植株體內過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸裂解酶(PAL)的含量明顯升高,說明它們也可能參與了抗性機制。BABA可以誘導番茄和瓜類根部木質化和表達過氧化物酶,而該酶的一些同工酶可能參與H2O2的產生?，F已證實H2O2及其產生的活性氧在植物抗病作用中,可能存在如下作用:(1)直接攻擊入侵的病原物,造成病原物細胞質膜過氧化,膜通透性增大,膜電位下降,從而降低病原物活性,抑制其繁殖,甚至殺死病原物。(2)在非親和互作中,快速交聯植物細胞壁中的一些結構蛋白,使細胞壁結構加固,從而增強對病原物釋放的水解酶的抵抗能力。(3)引發(fā)植保素的合成。(4)調節(jié)防衛(wèi)基因的表達。(5)誘導寄主發(fā)生過敏性反應與細胞死亡。番茄14C-β-氨基丁酸同位素示蹤試驗也表明,大部分14C-BABA完整地進入番茄植物體,而只有一小部分可能直接或者通過交聯與細胞壁聯結,這些結果支持了BABA的聯結目標可能是細胞壁蛋白這一假說。最近一些研究顯示,番茄和煙草細胞壁共價聯結的14C-BABA能溶于K-蛋白酶、纖維素酶和果膠酶。這些細胞壁聯結蛋白或細胞壁交聯蛋白使寄主細胞壁能抵抗真菌酶類的降解。此外,BABA不能誘導辣椒素的積累,但可提高辣椒對疫霉菌侵染發(fā)生反應時合成辣椒素的能力。2.2木霉菌對實生品中樣品中微生物指標的影響Ahmed-Sid-Ahmed等以木霉菌的孢子懸浮液處理辣椒種子或灌根,誘導植株獲得了對疫病的系統(tǒng)抗性。他們的方法是用木霉菌的孢子懸浮液處理辣椒種子,然后在辣椒幼苗長至5片真葉時挑戰(zhàn)接種疫霉菌,并于接種后的3、6、9d分別調查接種和未接種植株上的壞死斑的長度分別是2.4、14.8、27.7和5.3、22.9、48.6mm;灌根處理的植株也獲得相似的結果。這些試驗結果清楚地顯示出辣椒枝干經木霉菌預處理后,其壞死斑的擴展明顯受到抑制,即疫霉菌的侵染速度顯著降低。而在壞死斑及其周圍區(qū)域,只能分離到疫霉菌,卻分離不出木霉菌;只有從處理的根部或根際區(qū),才可以分離到木霉菌。這些結果證明木霉菌處理辣椒,對疫病產生的抗性是通過誘導獲得的,而且這種抗性可能是多個微效基因控制的數量抗性。木霉菌處理與挑戰(zhàn)接種植株后,植株體內辣椒含量變化差異較大:接種后3d,接種和未接種植株體內的辣椒素含量雖相差不大,但6d后,前者是后者的7.4倍,9d后,后者含量明顯增加,而前者則含量下降到與未接種處理植株的含量水平相似。木霉菌預處理可以誘導辣椒對相距甚遠的疫霉菌的侵染產生抗性,這種抗性的部分作用機制可能是有抑制性的代謝物質產生,以及木霉菌在寄主中與疫霉菌爭奪空間和養(yǎng)分,并在競爭中占據了主動。木霉菌產生的木聚糖酶可誘導煙草和番茄表達一種T-Sumo蛋白,而這種蛋白被認為參與了防御反應機制?？傊?木霉菌可能通過多種途徑參與包括誘導抗性在內的多種抗性反應。植株在壞死區(qū)域產生辣椒素,可以延緩疫霉菌的生長和減少侵染,并通過與防御反應中的別的因子聯合,在誘導抗性中起作用。3灌根保護兩組植株對炭疽病的抗性JeumKynHong等從AABA、BABA和GABA的抑菌活性實驗發(fā)現,1000μg/mL的AABA在培養(yǎng)基中對炭疽菌絲的抑制率僅有29%,而同濃度的BABA和GABA則沒有抑制作用;在濃度100μg/mL時,這三種同分異構體均不影響炭疽菌絲正常生長。用BABA噴灑六葉期的辣椒葉部,4d后接種1.5×105個分子孢子/mL的炭疽病菌,其病斑隨BABA濃度增加而減少,濃度達1000μg/mL就可完全保護辣椒免受炭疽病侵染;用AABA處理的椒苗,其炭疽病斑也隨濃度增加而減少,并在1000μg/mL時達到75%的最大保護效果;而GABA處理的效果則很不明顯。改用灌根處理椒苗,也可觀察到BABA比AABA和GABA能更有效誘導植株對炭疽病的抗性,BABA在濃度100μg/mL和1000μg/mL時,分別可提供73%和85%的保護;而1000μg/mL的AABA和GABA只能分別達到60%和35%的保護。用1000μg/mL的BABA對八葉期的辣椒進行灌根,并分別于5、10和15d后接種炭疽病菌,可分別達到93%、96%和85%的保護;與此相反,如處理后立即接種,則10、100和1000μg/mL的BABA均只能達到50%左右的保護。接種后8d調查病斑大小發(fā)現,未處理植株的病斑直徑為2.5mm,而BABA處理者的病斑直徑介于0.9～2.0mm之間,且隨著BABA的濃度增加而逐漸減小。這些結果表明BABA灌根處理后5d再挑戰(zhàn)接種,可有效地降低辣椒葉片上病斑的大小。對BABA處理下部兩片葉片所誘導的系統(tǒng)抗性研究發(fā)現,雖然下部兩片葉片單位面積內的病斑數沒有明顯不同,但BABA處理后7d接種炭疽病菌的植株,其上部葉片的病斑數明顯比處理后1d接種的要少得多,且病斑直徑減小。這些結果也反映出植株經BABA誘導后需要一段時間的積累才能產生足夠的抗性物質。問題和視角的未來(1)缺乏有效的誘導抗性從對病毒病的研究我們了解到病毒弱毒株系和衛(wèi)星RNA確實可以誘導辣椒對強毒株系的侵染產生抗性,但是由于這些弱毒株系和衛(wèi)星RNA都與其強毒株系有很高的同源序列—有的僅只有幾個堿基的差異—而病毒又極易發(fā)生突變,它們極有可能由原來的減弱病情突變?yōu)樵鰪姴∏?導致更嚴重的病害發(fā)生。此外,確定合適的預接種時間也是至關重要的,因為接種過早,可能適得其反,引起不必要的減產;過晚則不起作用。但要做到適時接種目前還做不到。因而這一方法在短