注：相同天數(shù)下，同行無(wú)字母或有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，有不同字母表示差異顯著（P＜0.05）2.3.3對(duì)鈣、磷代謝產(chǎn)物的影響檢測(cè)結(jié)果如表2.8所示，母豬妊娠85天血清內(nèi)OPG、RNAKL、1,25(OH)2D3、25(OH)D3、TRAP、CT激素在各組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。妊娠114天母豬檢測(cè)結(jié)果顯示：25(OH)D3的含量在4組之間沒(méi)有太大變化。RNAKL、1,25(OH)2D3在各組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，但兩者在添加25(OH)D3的組內(nèi)水平較高。OPG激素水平在LCa組最高，其次依次是LCa+VD組、VD組和CON組，同時(shí)雙因素方差結(jié)果表明鈣以及鈣和VD的共同作用在OPG水平變化中起主效應(yīng)(P＜0.05)。LCa+VD組內(nèi)CT激素水平低于其他三組，且與VD組差異極顯著(P＜0.05)。表2.8母豬鈣、磷代謝產(chǎn)物的影響Table2.8Effectsofcalciumandphosphorusmetabolitesinsows項(xiàng)目妊娠85天妊娠114天雙因素方差分析（P）CON組LCa組VD組LCa+VD組CON組LCa組VD組LCa+VD組CaVDCa×VDOPG(pg/mol)1400.17±297.76a1575.02±495.03a1402.82±163.38a1319.27±290.47a1534.69±107.85a1567.37±65.47a1776.45±201.70a1665.69±55.94a0.0190.1160.004RANKL(pmol/L)37.42±8.55a36.90±17.93a30.90±2.89a29.27±7.63a38.70±5.99a44.37±6.73a43.40±6.92a35.62±2.17a0.6390.2370.6121,25(OH)2D3(ng/L)43.63±7.63a47.39±11.62a43.51±6.72a37.71±3.55a43.31±2.02a52.13±8.35a47.05±0.94a50.27±3.94a0.7000.0260.26225(OH)D3(μg/L)4.44±0.86a3.97±0.65a3.97±0.65a3.97±0.65a4.47±0.21a4.74±0.69a4.77±0.26a4.62±0.18a0.6490.7800.313TRAP(pg/mol)1135.56±302.88a1718.15±382.15a1626.78±285.30a1018.46±448.45a1142.98±143.96a1243.72±181.14a1735.30±221.22a1551.66±168.30a0.0030.3010.062CT(ng/L)149.53±36.98a128.05±32.20a128.05±32.20a128.05±32.20a134.63±4.26ab132.08±8.37a143.91±7.45ab118.38±15.20b0.0730.6450.958注：相同天數(shù)下，同行無(wú)字母或有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，有不同字母表示差異顯著（P＜0.05）2.3.4對(duì)激素的影響檢測(cè)結(jié)果如表2.9所示，母豬妊娠85天血清內(nèi)E2、EPO、PTH、T4、Cor激素在各組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)，證明各組母豬血清內(nèi)的激素含量是處于同一水平的。在飼養(yǎng)至母豬妊娠114天，與CON組相比，VD組E2激素含量顯著降低(P＜0.05)，但EPO激素含量顯著上升(P＜0.05）。妊娠114天，母豬血液內(nèi)T4激素含量相比85天均有升高，但各組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)；LCa組母豬血清中PTH含量顯著高于VD組和LCa+VD組(P＜0.05)，但與CON組相比沒(méi)有差異(P>0.05)。Cor激素在LCa+VD組含量最高，且顯著高于VD組(P＜0.05)，除此之外，其他各組之間均差異不顯著(P>0.05)。主效應(yīng)分析表明，飼糧中添加25(OH)D3可顯著提高母豬EPO的激素水平(P＜0.05)，低鈣的情況下可造成Cor含量上升。表2.9各組妊娠85天和114天母豬血清中激素表達(dá)水平Table2.9serumhormonelevelsofsowsineachgroupat85and114daysofgestation項(xiàng)目妊娠85天妊娠114天P-valueCON組LCa組VD組LCa+VD組CON組LCa組VD組LCa+VD組CaVDCa×VD雌二醇(pmol/L)85.64±22.3887.62±21.9576.17±9.1670.54±19.97100.64±19.96a93.08±7.8584.44±7.95b91.80±10.110.670.7940.902促紅細(xì)胞生成素（pg/mol）83.15±20.5290.70±16.4377.15±4.7679.27±17.5293.33±7.48a98.21±7.02108.24±12.18b104.50±10.690.7630.0230.722甲狀旁腺素（pg/mol）210.93±73.05238.51±70.88208.04±60.04180.65±20.88197.21±18.85242.96±11.66a177.05±47.23b175.89±39.30b0.4090.280.607皮質(zhì)醇（ug/L）54.24±9.2773.38±5.0680.78±20.39b51.29±13.9461.72±9.11ab70.68±3.39abc59.26±8.97ad75.30±5.17b0.0040.3360.051甲狀腺素（pmol/L）634.31±180.69659.31±89.79683.38±72.99695.43±96.48744.92±33.87733±101.88759.49±99.47715±24.880.440.3940.858注：相同天數(shù)下，同行無(wú)字母或有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，有不同字母表示差異顯著（P＜0.05）2.3.5對(duì)氧化應(yīng)激的影響如表2.10所示，母豬妊娠85天時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)在各組之間均無(wú)顯著差異.隨著在妊娠后期飼糧中鈣含量的減少和25(OH)D3的添加，妊娠母豬114天時(shí)血清中含量與CON組相比，LCa組的ROS、CAT含量顯著降低(P＜0.05)，VD組的ROS含量顯著降低，但SOD、CAT、GSH-Px的含量顯著增高(P＜0.05)；與LCa組相比，LCa+VD組血清中SOD、CAT、GSH-Px的含量顯著增高(P＜0.05)；血清中MDA的含量組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。主效應(yīng)分析表明，血清中ROS指標(biāo)的變化與Ca×VD的聯(lián)合效應(yīng)有關(guān)(P=0.05)，SOD、CAT、GSH-Px指標(biāo)的變化均與VD有顯著關(guān)系(P＜0.05)，血清中MDA指標(biāo)的變化與三者無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)。表2.10各組妊娠85天和114天母豬血清中抗氧化指標(biāo)水平Table2.10Serumantioxidantlevelsofsowsineachgroupat85and114daysgestation項(xiàng)目妊娠85天妊娠114天P-valueCON組LCa組VD組LCa+VD組CON組LCa組VD組LCa+VD組CaVDCa×VD活性氧（FIR）6.37±0.857.60±1.356.68±1.095.67±1.745.91±0.37a4.57±0.48bc4.06±0.98c5.34±0.34ab0.9220.1580.005超氧化物歧化酶（U/mL）20.80±0.3220.68±0.521.05±0.2420.84±0.320.71±0.54a20.46±0.92a22.29±0.87b22.52±0.4b0.660.010.996過(guò)氧化氫酶（U/mL）4.41±0.334.45±0.224.64±0.224.58±0.234.71±0.31a4.18±0.23c5.36±0.45b5.62±0.23b0.4840.0010.056谷胱甘肽過(guò)氧化酶(U/mL)708.36±10.98712.75±25.54737.45±23.08708.35±2.52728.11±15.18a725.51±13.29a762.75±10.41b782.08±21.87b0.3880.0010.258丙二醛(nmol/L)8.95±0.368.95±0.958.33±0.369.10±0.369.58±0.29.16±0.958.75±0.628.75±0.520.6080.1470.608注：相同天數(shù)下，同行無(wú)字母或有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，有不同字母表示差異顯著（P＜0.05）2.3.6對(duì)血液、乳汁微量元素的影響血液微量元素如圖2.3（A~F）所示，各組血液中的微量元素Cd、Se、Cr、Mn的含量無(wú)明顯差異。其血液中Cu元素的含量，LCa+VD組顯著高于VD組(P<0.05)。與此同時(shí)血液中As元素的含量，LCa+VD組極顯著高于其它組別（P<0.01）。乳汁微量元素如圖2.4（A~F）所示，乳汁中微量元素Se和Cr的含量，LCa組、LCa+VD組極顯著高于CON組（P<0.01），其Se元素的含量，LCa組極顯著高于LCa+VD組（P<0.01），Cr元素的含量LCa組顯著高于LCa+VD組(P<0.05)。微量元素Cu的含量，LCa組、VD組顯著高于CON組(P<0.05)，LCa+VD組極顯著高于CON組（P<0.01）。乳汁中Cd和Mn元素的含量，CON組和LCa組分別顯著高于VD組(P<0.05)。圖2.3血液微量元素Figure2.3Thetraceelementsofblood注：*代表P<0.05(差異顯著)，**代表P<0.01(差異極顯著)圖2.4乳汁微量元素Figure2.4Thetraceelementsofmilk注：*代表P<0.05(差異顯著)，**代表P<0.01(差異極顯著)2.3.7血液代謝組學(xué)分析的結(jié)果PCA模式識(shí)別本試驗(yàn)基于HILICULPLC-Q-TOFMS技術(shù)，采用ProgenesisQI軟件對(duì)代謝物離子峰進(jìn)行提取，在正離子和負(fù)離子模式下分別鑒定出代謝產(chǎn)物。之后將代謝物離子峰進(jìn)行PCA分析，使數(shù)據(jù)降維從而提取數(shù)據(jù)的主要特征。PCA得分圖如圖2.5所示，可以觀察各組樣本的代謝輪廓。其中，QC樣本較為集中且未出現(xiàn)明顯漂變，說(shuō)明數(shù)據(jù)采集過(guò)程中，機(jī)器性能穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好。同時(shí)，所有樣本的PCA得分圖均出現(xiàn)在95%的置信區(qū)間（橢圓內(nèi)），表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性高。圖2.5血清PCA得分圖Figure2.5PCAscoreplotofserumOPLS-DA模式分析對(duì)組間差異代謝物進(jìn)行OPLS-DA分析，其中R2Y代表Y變量的可解釋程度，Q2代表模型的可預(yù)測(cè)性。一般情況下，R2和Q2的值大于0.5即可代表該模型較為穩(wěn)定。模型參數(shù)如表2.11所示，在該模型中R2Y和Q2均大于0.5，表示模型預(yù)測(cè)結(jié)果較好，統(tǒng)計(jì)結(jié)果可靠。同時(shí)，由圖2.7也可以看出隨機(jī)置換的R2和Q2高于原始OPLS-DA模型的R2和Q2值的分布，表明四個(gè)OPLS-DA模型是有效的。表2.11OPLS-DA模型參數(shù)Table2.11theparametersrelatedtoOPLS-DAmodelsComparisonR2XR2YQ2CON/LCa0.590.9870.799CON/VD0.7240.9980.97LCa/LCa+VD0.730.9980.972VD/LCa+VD0.6730.970.768圖2.6OPLS-DA代謝分析圖。（A）和（B）CON組與LCa組相比，OPLS-DA得分圖和置換檢驗(yàn)得分圖。（C）和（D）CON組與VD組相比，OPLS-DA得分圖和置換檢驗(yàn)得分圖。（E）和（F）LCa組與LCa+VD組相比，OPLS-DA得分圖和置換檢驗(yàn)得分圖。（G）和（H）VD組與LCa+VD組相比，OPLS-DA得分圖和置換檢驗(yàn)得分圖。Figure2.6OPLS-DAanalysesofthemetaboliteprofile.(A)and(B)OPLS-DAplotoftheCONandLCagroupsandpermutationtestoftheOPLS-DAmode.(C)and(D)OPLS-DAplotoftheCONandVDgroupsandpermutationtestoftheOPLS-DAmode.(E)and(F)OPLS-DAplotoftheLCaandLCa+VDgroupsandpermutationtestoftheOPLS-DAmode.(G)and(H)OPLS-DAplotoftheVDandLCa+VDgroupsandpermutationtestoftheOPLS-DAmode.差異代謝物的篩選根據(jù)差異代謝物鑒定結(jié)果，得出差異代謝物的名稱、核質(zhì)比、保留時(shí)間等代謝產(chǎn)物的信息，并對(duì)代謝物峰面積進(jìn)行歸一化處理。之后，挑選出其中P值大于0.05且OPLS-DA分析后VIP>1的代謝物。如表2.11所示，與CON組相比，LCa組和VD組分別篩選出17種和48種差異代謝物；與LCa組相比，LCa+VD組篩選出68種差異代謝物；與VD組相比，LCa+VD組篩選出19種差異代謝物。之后，對(duì)每?jī)山M間的差異代謝物進(jìn)行比較，以發(fā)現(xiàn)其中共有或特有的差異代謝物，結(jié)果如圖2.7所示。從圖2.7可以看出，飼料中含有不同濃度的鈣離子及VD時(shí)，母豬血清中共有的差異代謝物數(shù)量和比例。其中，有12種差異物質(zhì)在四組中均發(fā)生顯著的變化。同時(shí)，在母豬血液中，共有81種不同的物質(zhì)受到飼料中鈣離子濃度和VD濃度的影響。對(duì)血液種分析得到的這81種物質(zhì)進(jìn)行分層聚類分析，結(jié)果如圖2.8所示。由聚類熱圖可知，CON組、LCa組、VD組和LCa+VD組四組樣品聚類清晰，可明顯區(qū)分，說(shuō)明在四組中母豬血清中的物質(zhì)發(fā)生了明顯的變化。表2.12血清中的差異代謝物Table2.12Differentialmetabolitesinserumm/zAcceptedDescriptionCONgroupvs.LCagroupVIPCONgroupvs.VDgroupVIPLCagroupvs.LCa+VDgroupVIPVDgroupvs.LCa+VDgroupVIP127.027Dimethylurea1.30331*227.0016Homovanillicacidsulfate1.54736*1.35452**283.0815p-Cresolglucuronide1.30112*843.6708Culinariside1.29809**1.446588**647.5404Faradiollaurate1.47852*1.33872*1.44485**1.49243**898.7065PC(o-18:0/24:0)1.30959**909.702PC(24:0/16:0)1.36381**1.45453**1.89819**797.616PE(P-18:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))1.89888**1.34598**1.38631**867.658PE(24:0/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))1.60784**1.3591**1.45546**1.86366**303.0806Methionyl-Methionine1.56753**1.3428**1.45444**1.91549**363.1453AflatoxinB1dialcohol1.35033*1.34375*1.46109**1.77814**381.1166Phlorisobutyrophenone2-glucoside1.32107*1.45341**169.0368D-1-Amino-2-pyrrolidinecarboxylicacid1.34523*1.46221**1.89399**173.0296Dihydrothymine1.44846*1.32052*1.46135**1.90222**319.0523Trifluridine1.44752**413.199Tyrosol1.01926*395.1885Citrulline1.07373**1.02602*330.3017PalmitoylSerinol1.35922*1.46083**1.89472**397.2054Sunitinib1.12618**1.00146*205.13742-ArachidonylGlycerolether1.57031**1.25572**1.43821**1.8822**251.0948Methionyl-Histidine1.34536*325.27263b,17b-Dihydroxyetiocholane1.34619**253.2169Palmitoleicacid1.01925*327.2325Docosahexaenoicacid1.0831**279.23379E,11E-Octadecadienoicacid1.10958**1.27544*329.248Docosapentaenoicacid1.06396**508.3413LysoPC(17:0)1.01975*568.3627LysoPC(0:0/18:0)1.04857**305.24795,8,11-Eicosatrienoicacid1.04038*1.07789**255.2336Palmiticacid1.16285**1.31884**385.1899Methantheline1.20692**281.2491Oleicacid1.11234**1.31112**383.2956Testosteroneenanthate1.16082**458.256110,11-Dihydro-12R-hydroxy-leukotrieneE41.40121**307.2639Alpha-Terpineol1.03141*1.0727**283.2648Stearicacid1.17159**1.378**385.3096Oryzarol1.22329**413.2206Propantheline1.28507**419.33917a,12a-Dihydroxy-5a-cholestan-3-one1.3458*1.45464**801.6349DG(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)/24:0/0:0)1.34245*1.45101**551.5011DG(18:0/14:0/0:0)1.41295**607.3846(24E)-3alpha,15alpha-Diacetoxy-23-oxo-7,9(11),24-lanostatrien-26-oicacid1.40157*1.34266*1.45022**1.60476**708.4803PS(16:0/14:0)1.25445*1.33435*1.43884**1.76341**850.5616Lactosylceramide(d18:1/12:0)1.03675**561.447DG(14:0/16:1(9Z)/0:0)1.42867**913.4463Lc3Cer1.69759**1.29805**1.36706**1.15205*407.773PC(15:0/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))1.53579*1.35407**742.5399PE(18:2(9Z,12Z)/18:0)1.13703**1.24568**504.3541HovenineA1.72361**1.02603**1.32075**1.11933*810.5645PE(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/P-18:1(11Z))1.21429*563.4641DG(15:0/15:0/0:0)1.35336**878.5928PC(18:1(11Z)/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))1.09067**1.09487**924.4783PS(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))1.23664*489.7661CDP-DG(16:0/18:2(9Z,12Z))1.41419**794.565PE(20:0/18:1(11Z))1.086**854.5926PC(18:0/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))1.04047*1.18476**446.7919PE(24:1(15Z)/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))1.3462**1.44098**770.5709PE(18:2(9Z,12Z)/20:0)1.16084**1.26501**787.449PG(16:1(9Z)/18:3(9Z,12Z,15Z))1.09837**966.5659Trihexosylceramide(d18:1/12:0)1.32239*924.7014PC(24:0/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))1.25912**528.3411LysoPC(P-18:1(9Z))1.34333**1.35652**796.5842PE(18:0/20:0)1.04672*603.5096Hexacosanoylcarnitine1.67469**1.34865**1.42447**1.72986**832.6082PC(18:1(9Z)/18:0)1.08224**1.1163**794.666DG(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/24:0/0:0)1.44641**897.6143PC(20:3(5Z,8Z,11Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))1.2667*1.3462**1.33039*857.6735PC(22:0/18:3(6Z,9Z,12Z))1.63947**1.34433**1.46107**1.85856**846.672PE(24:1(15Z)/22:2(13Z,16Z))1.4063**1.66192**902.6558PE(24:0/20:1(11Z))1.37297**719.5368PC(14:1(9Z)/16:1(9Z))1.05641**851.6477Galactosylceramide(d18:1/24:1(15Z))1.27114**841.6568SM(d18:0/23:0)1.4538**圖2.7不同處理間共有和特有的差異代謝產(chǎn)物Figure2.7Commonanduniquedifferentialmetabolitesamongdifferenttreatments.圖2.8各組母豬血清中潛在生物標(biāo)志物熱圖分析Figure2.8Heatmapanalysisofpotentialbiomarkersinserumofsowsfromeachgroup血清中差異代謝物的通路分析為了進(jìn)一步探討飼料中鈣和維生素D對(duì)母豬血清代謝物的影響，將初步篩選出的差異代謝物信息導(dǎo)入MetaboAnalyst3.0數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)路徑拓?fù)浞治觯╬athwaytopologyanalysis）計(jì)算影響值（Impactvalue）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后，將影響值大于0.1的代謝通路定義為潛在靶標(biāo)路徑，認(rèn)為該代謝通路具有重要影響。如圖2.9（A）所示，CON組與LCa組相比，主要有以下代謝路徑發(fā)生了變化：甘油磷脂代謝（Glycerophospholipidmetabolism），亞油酸代謝（Linoleicacidmetabolism），α-亞麻酸代謝（alpha-Linolenicacidmetabolism）和糖基磷脂酰肌醇生物合成（Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchorbiosynthesis）等。如圖2.9（B）所示，CON組與VD組相比，主要有以下代謝路徑發(fā)生了變化：不飽和脂肪酸生物合成途徑（Biosynthesisofunsaturatedfattyacids），甘油磷脂代謝（Glycerophospholipidmetabolism），花生四烯酸代謝（Arachidonicacidmetabolism），亞油酸代謝（Linoleicacidmetabolism），α-亞麻酸代謝（alpha-Linolenicacidmetabolism），精氨酸生物合成（Argininebiosynthesis），糖基磷脂酰肌醇生物合成（Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchorbiosynthesis）等。如圖2.9（C）所示，LCa組與LCa+VD組相比，主要有以下代謝路徑發(fā)生了變化：不飽和脂肪酸生物合成途徑（Biosynthesisofunsaturatedfattyacids），鞘脂類代謝（Sphingolipidmetabolism），甘油磷脂代謝（Glycerophospholipidmetabolism），亞油酸代謝（Linoleicacidmetabolism），α-亞麻酸代謝（alpha-Linolenicacidmetabolism）和糖基磷脂酰肌醇生物合成（Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchorbiosynthesis）等。如圖2.9（D）所示，VD組與LCa+VD組相比，主要有以下代謝路徑發(fā)生了變化：甘油磷脂代謝（Glycerophospholipidmetabolism），亞油酸代謝（Linoleicacidmetabolism），α-亞麻酸代謝（alpha-Linolenicacidmetabolism）和糖基磷脂酰肌醇生物合成（Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchorbiosynthesis）等。圖2.9血清中關(guān)鍵代謝物的通路分析。（A）CON組與LCa組相比，差異代謝物通路分析。（B）CON組與VD組相比，差異代謝物通路分析。（C）LCa組與LCa+VD組相比，差異代謝物通路分析。（D）VD組與LCa+VD組相比，差異代謝物通路分析。Figure2.9Pathwayanalysisofthekeymetabolitesintheserum.(A)PathwayanalysisofthedifferentialmetabolitesbetweentheCONgroupandtheLCagroup.(B)PathwayanalysisofthedifferentialmetabolitesbetweentheCONgroupandtheVDgroup.(C)PathwayanalysisofthedifferentialmetabolitesbetweentheLCagroupandtheLCa+VDgroup.(D)PathwayanalysisofthedifferentialmetabolitesbetweentheVDgroupandtheLCa+VDgroup.2.4討論2.4.1對(duì)母豬生產(chǎn)性能的影響產(chǎn)出小豬總數(shù)，往往跟妊娠12天左右胚胎著床情況有關(guān)ADDINNE.Ref.{C929480B-EE36-4E0A-8A9A-CAF0C01CE6F3}(程伶,2006)，由于25(OH)D3是在妊娠后期添加入飼料，由于決定時(shí)間在處理之前，從邏輯上來(lái)說(shuō)，添加25(OH)D3和調(diào)整飼料鈣含量與總仔數(shù)無(wú)關(guān)。木乃伊胎與豬的個(gè)體狀況有關(guān)，發(fā)生因素比較復(fù)雜，有些木乃伊是較早發(fā)生與處理無(wú)關(guān)；有些大木乃伊則發(fā)生在處理之后，包括病毒因素等也可以引起大木乃伊出現(xiàn)，本身差異也不顯著，無(wú)意義。死胎主要與母豬分娩應(yīng)激有關(guān)，主要是血管應(yīng)激下導(dǎo)致的仔豬缺氧引起。而血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激反應(yīng)維生素D作為一種抗氧化劑，能幫助機(jī)體對(duì)抗應(yīng)激ADDINNE.Ref.{77B04E4B-0E22-4641-AC5A-C0BEDDF2BA27}(王偉等,2017)，考慮到25(OH)D3是1,25(OH)2D3的前體，調(diào)節(jié)鈣，這個(gè)數(shù)據(jù)與其抗應(yīng)激和調(diào)節(jié)血鈣有關(guān)。而至于窩均重，我們引入變異系數(shù)，變異系數(shù)可以顯示各組內(nèi)的離散程度ADDINNE.Ref.{6F2E4816-19A6-466C-8050-6D30FABB1786}(王文森,2007)，或者叫均勻度的情況，變移系數(shù)越小則均勻度越好；進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)各組變異系數(shù)：LCa組24.6%，低鈣補(bǔ)充VD組：11.66%，CON組：30.30%，正常鈣補(bǔ)充VD組：10.33%，有更好的均勻度對(duì)小豬以后的成長(zhǎng)是有利的。2.4.2對(duì)血清生化指標(biāo)的影響研究表明，孕中晚期是胎兒發(fā)育的主要階段，母體鈣的缺乏可能會(huì)影響胎兒成骨細(xì)胞的活性，影響胎兒骨骼發(fā)育ADDINNE.Ref.{E0B70192-F5BF-4E2F-88DB-27759677CAE8}(代惠英等,2019)。成骨細(xì)胞是維生素D的靶器官，維生素D可以影響成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)骨橋蛋白、骨鈣蛋白以及骨的合成ADDINNE.Ref.{BE873234-970B-4BB0-ADD5-5AFC2C0FC90B}(楊波等,2014)。因而，孕晚期25(OH)D3水平低的孕婦，其子代更易出現(xiàn)血鈣反饋調(diào)節(jié)，刺激胎兒甲狀旁腺激素/甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTH/PTHrp)的產(chǎn)生及活性，導(dǎo)致皮質(zhì)骨受限，主要表現(xiàn)為骨生長(zhǎng)變慢ADDINNE.Ref.{8E8C4B82-C8B3-4DEE-AE41-E6EF9E3A28C6}(Tobiasetal.,2004)。因此，需要考慮母豬在大負(fù)荷生產(chǎn)的情況下，其鈣流失較人的相對(duì)年齡為早進(jìn)而引起生產(chǎn)能力下降，并且對(duì)后代的骨骼發(fā)育影響巨大，這是補(bǔ)充25(OH)D3對(duì)母豬維持整體生產(chǎn)性能的一個(gè)證據(jù)。對(duì)于UA和GLU兩個(gè)指標(biāo)，許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體研究表明,維生素D在糖脂代謝中發(fā)揮著改善胰島抵抗、增加胰島素分泌ADDINNE.Ref.{499CF614-2FBD-48A3-9810-E729B286F9DA}(盧云飛等,2018)。維生素D可促進(jìn)胰島β細(xì)胞維生素D受體的表達(dá)從而促進(jìn)胰島素的分泌,通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子而影響葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)改善胰島素抵抗ADDINNE.Ref.{1E58F280-8ACB-4DA7-8FA9-A3CA07C08FBA}(Alvarezetal.,2010)。妊娠期間母體的維生素D的缺乏可以引起機(jī)體的糖脂代謝紊亂。而LCa組血糖最低說(shuō)明在飼養(yǎng)管理較差的豬場(chǎng)導(dǎo)致母豬低鈣情況下，機(jī)體的糖代謝出現(xiàn)了紊亂，而在補(bǔ)充維生素D可以使血糖水平升高。血糖的降低引發(fā)胎兒無(wú)法獲得足夠能量，可能是大胎齡母豬生產(chǎn)性能下降迅速的原因之一，因此，對(duì)大胎齡母豬保持較高的鈣水平和補(bǔ)充25(OH)D3可能對(duì)維持生產(chǎn)性能很重要。有研究報(bào)道ADDINNE.Ref.{8B3E7D4D-865B-4E06-B034-20CC9B968F43}(Li,2012)，維生素D缺乏常見(jiàn)于慢性腎病，尿酸和尿酸鹽在腎臟過(guò)濾并排泄，而大部分(90%)尿酸和尿酸鹽被再吸收并返回血液。因此,腎功能不全會(huì)減少尿酸的排泄,從而使血循環(huán)中尿酸濃度升高ADDINNE.Ref.{56D6F668-5186-4F58-9027-D9F8105F53DF}(Ejazetal.,2007)。本研究中UA在LCa組最高，添加25(OH)D3有助于降低其水平，尤其是在缺乏鈣供給的情況下。表明了飼料中添加25(OH)D3可以預(yù)防尿酸的積累，從而使機(jī)體不會(huì)在妊娠期間發(fā)生高尿酸血癥。2.4.3對(duì)鈣、磷代謝產(chǎn)物的影響25(OH)D3在腎臟中可以轉(zhuǎn)化為有活性的1,25(OH)2D3，本試驗(yàn)中，雖然25(OH)D3的含量在4組之間沒(méi)有太大變化，但1,25(OH)2D3的激素水平在添加25(OH)D3的組內(nèi)較高。有研究表明，1,25(OH)2D3能促進(jìn)RANKL的mRNA表達(dá)，同時(shí)運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2D3可以抑制OPG蛋白形成ADDINNE.Ref.{49F6C430-A137-4454-B468-A2954D1CF332}(田慶顯,2004)。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之大致相符。在本試驗(yàn)中，VD組母豬血液中OPG、RNAKL激素水平高于CON組(P>0.05)。母豬妊娠晚期易因胎兒發(fā)育導(dǎo)致血鈣濃度降低ADDINNE.Ref.{22D5A7E4-F078-4C0B-BBDF-B74EB22ECDE8}(Ohta,2019)，血鈣水平降低會(huì)促使骨吸收，OPG作為骨吸收的抑制劑分泌增多ADDINNE.Ref.{8C67274D-C154-4F73-8E59-3BCE52E223FD}(周莉等,2019;Kangetal.,2015)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果則印證了這一生理變化，LCa組仔豬血液中OPG含量最高，而LCa+VD組含量低于LCa組，但二者都高于CON組，說(shuō)明在相同情況下，添加維生素D能有效的促進(jìn)鈣吸收。然而降鈣素做為體內(nèi)維持血液鈣離子的物質(zhì)之一，LCa+VD組含量低于VD組同樣印證了OPG的變化。2.4.4對(duì)血液激素的影響膽骨化醇是補(bǔ)充維生素D常見(jiàn)的渠道，腸粘膜吸收膽骨化醇之后轉(zhuǎn)變?yōu)?5(OH)D3，繼而轉(zhuǎn)變?yōu)?,25-二羥基維生素D3(1,25(OH)2D3)。激素對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、代謝等起著重要的調(diào)節(jié)作用，適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)激素水平對(duì)機(jī)體是有益的ADDINNE.Ref.{730A4043-8809-47C3-BCDE-CD19D730A43C}(deMatos,2008;Lauridsenetal.,2010;Zhouetal.,2017)。鈣穩(wěn)態(tài)是通過(guò)腸道吸收、腎臟排泄和骨代謝來(lái)調(diào)節(jié)的，腸道主要通過(guò)腸上皮細(xì)胞對(duì)鈣進(jìn)行吸收，腎臟則利用其代謝及重吸收的功能，而骨則根據(jù)血鈣濃度促進(jìn)或抑制成骨及破骨細(xì)胞的分化來(lái)維持血鈣的平衡。這些過(guò)程受PTH、性激素和維生素D等調(diào)控ADDINNE.Ref.{01C02402-23AE-4363-83CC-86FE4F18FA26}(deMatos,2008)。PTH作為與機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要的激素之一，其含量與機(jī)體內(nèi)鈣和25(OH)D3的含量密不可分。機(jī)體可通過(guò)調(diào)節(jié)PTH的含量來(lái)控制血清內(nèi)25(OH)D3與鈣的平衡，當(dāng)機(jī)體缺乏維生素D時(shí)，PTH分泌增多，且血清中的PTH與25(OH)D3含量成反比ADDINNE.Ref.{2F555185-56C2-4E64-B273-3CCEE374CEE2}(Haddowetal.,2011;Pekkinenetal.,2014)。同時(shí)有研究表明ADDINNE.Ref.{A34D8DA1-D78A-46EC-A2E5-9EAA18369FBE}(主性等,2001)，PTH能動(dòng)員鈣從骨組織中釋放到血清中，低鈣會(huì)在一定程度上提高體內(nèi)PTH的表達(dá)量。在本研究中，LCa組母豬血清內(nèi)PTH含量最高，且LCa組母豬血清內(nèi)PTH含量顯著高于VD組和LCa+VD組，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)PTH、鈣、維生素D之間的相互影響做了印證。四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，VD組的E2激素表達(dá)量最低并顯著低于CON組，LCa+VD組表達(dá)量也低于CON組，但差異不顯著。母體妊娠8周之后，E2主要由胎兒-胎盤(pán)分泌，且妊娠后期母體E2水平上升會(huì)導(dǎo)致胎兒獲得的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，引起胎兒T4水平下降，生長(zhǎng)速度下降A(chǔ)DDINNE.Ref.{8C24120D-F01F-41C9-B9CF-3619EC3D5CDF}(陳勝等,2011;Bollweinetal.,2004)，可見(jiàn)25(OH)D3具有一定的抑制母豬體內(nèi)E2水平升高的作用，有益于胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。而本試驗(yàn)中，各實(shí)驗(yàn)組間母豬血清中T4含量均沒(méi)有顯著差異，若僅從數(shù)據(jù)的變化趨勢(shì)可見(jiàn)，母豬VD組血清內(nèi)T4含量最高，LCa組及LCa+VD組依次低于CON組。陳勝等ADDINNE.Ref.{5CC4A82E-7145-43E2-BC2E-187E244E8C8C}(2011)在對(duì)兔的研究中發(fā)現(xiàn)，母兔TH水平上升對(duì)初生仔兔TH水平無(wú)顯著影響。但有研究認(rèn)為，由與種間成熟期以及胎盤(pán)屏障的通透性的差異性，其結(jié)果會(huì)有一定的差異ADDINNE.Ref.{F1C80370-1653-4D30-9D47-AB8B64C6914C}(Buzzardetal.,2003)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)機(jī)體內(nèi)鈣和25(OH)D3的含量對(duì)T4水平?jīng)]有顯著的影響，但這也可能是由于母體在短時(shí)間內(nèi)自身的代償作用所導(dǎo)致。促紅細(xì)胞生成素（EPO）是由腎皮質(zhì)腎小管周圍間質(zhì)細(xì)胞和肝細(xì)胞分泌的一種激素類物質(zhì)，參與紅細(xì)胞前體細(xì)胞的分化與成熟。研究發(fā)現(xiàn)EPO在體內(nèi)可通過(guò)激活JAK/STAT信號(hào)通路促進(jìn)骨形態(tài)蛋白（BMP2）的產(chǎn)生和骨形成，同時(shí)EPO在體外可以直接激活間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞ADDINNE.Ref.{6D481029-9EC2-4DFD-A924-3876C654C7C1}(Kimetal.,2012)。用25(OH)D3喂養(yǎng)高胎齡母豬可改善骨代謝，提高骨狀態(tài)，同時(shí)也可增強(qiáng)初生仔豬的生長(zhǎng)性能及骨骼的發(fā)育ADDINNE.Ref.{01768A1F-EC18-4576-825E-92FBEBEEAACF}(Zhouetal.,2017)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，VD組母豬血清內(nèi)EPO激素水平顯著高于CON組，證明其具有提高EPO水平的作用。但有趣的是LCa組母豬血清中EPO含量均高于CON組，但差異不顯著。對(duì)各組EPO的表達(dá)量進(jìn)行分析后我們發(fā)現(xiàn)，25(OH)D3在母豬血清EPO的變化中起主效應(yīng)。Cor是一種內(nèi)源性的糖皮質(zhì)激素，參與哺乳動(dòng)物各種復(fù)雜的生物效應(yīng)，如生長(zhǎng)、免疫反應(yīng)和新陳代謝，在機(jī)體受到壓力時(shí)會(huì)升高。試驗(yàn)結(jié)果顯示，VD組母豬血清中Cor含量最低，由此推斷25(OH)D3可以減輕母豬孕期/分娩壓力。對(duì)各組母豬血清內(nèi)Cor含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，鈣在Cor的表達(dá)中其主效應(yīng)。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出以下結(jié)論：在低鈣的情況下，母豬體內(nèi)血清中的PTH含量會(huì)顯著升高，以此來(lái)提高血鈣濃度避免鈣含量的失衡，而25(OH)D3在一定程度上降低了因低鈣導(dǎo)致的PTH升高，這可能是由于25(OH)D3有效地促進(jìn)了母豬機(jī)體對(duì)鈣的吸收，提高了血鈣濃度。25(OH)D3還可抑制母體E2激素水平的上升，提高胎兒對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，有利于胎兒的生長(zhǎng)及發(fā)育。雖然4個(gè)組別之間的EPO水平并未產(chǎn)生顯著性差異，但從數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)上來(lái)看，25(OH)D3可能具有提升母豬體內(nèi)EPO含量的作用，當(dāng)母豬處于缺鈣的情況下，破骨細(xì)胞增多促使骨組織中的鈣進(jìn)入血液，極易導(dǎo)致母豬發(fā)生生產(chǎn)癱瘓，而EPO水平的提高可維系成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化平衡。綜上所述，25(OH)D3可有效改善母豬懷孕期間的血液激素水平，保障母豬在懷孕期間的正常生理代謝及胎兒的健康成長(zhǎng)。2.4.5對(duì)母豬抗氧化指標(biāo)的影響在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)存在一整套完善的抗氧化系統(tǒng)，主要的抗氧化酶包括超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽還原酶(GR)等ADDINNE.Ref.{731C55FB-ACF5-41B6-A534-EF3918D15CAD}(Grossman,1985)?？寡趸改芗皶r(shí)清除體內(nèi)自由基，使機(jī)體免受損害，自由基的產(chǎn)生與清除保持動(dòng)態(tài)平衡ADDINNE.Ref.{93BCEF6D-FD18-4220-BC72-E404EEEAE3FB}(劉好朋等,2011)。SOD、GSH-Px能和氧自由基反應(yīng)生成氧分子和過(guò)氧化氫，同時(shí)這2種酶對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用ADDINNE.Ref.{31D1D23E-0AC7-4762-BCDB-E105D42261E0}(Medeirosetal.,1987)。超氧化物歧化酶(SOD)是機(jī)體內(nèi)主要的自由基清除酶，是能有效清除生物氧化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基,并能終止自由基連鎖反應(yīng),保護(hù)細(xì)胞免受損傷。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)機(jī)體內(nèi)存在的含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的系統(tǒng)，可以清除活性氧和酯質(zhì)過(guò)氧化物，GSH-Px在GSH的參與下可清除過(guò)氧化氫和脂質(zhì)過(guò)氧化物，抑制自由基的生成，因此，SOD、GSH-Px的活性可反映體內(nèi)抗脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,從而表明機(jī)體受損傷的程度.前人研究ADDINNE.Ref.{76958247-37EB-4041-85C0-B6EDD9D42B5D}(付京花等,2009)發(fā)現(xiàn)脂溶性維生素D有一定的抗氧化能力,因?yàn)榫S生素D是細(xì)胞膜質(zhì)抗氧化劑,以防止鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化,從而防止自由基對(duì)細(xì)胞的損傷ADDINNE.Ref.{C96E0724-1CB8-4392-BCF0-39F2608ED9B2}(張淑云,2011)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：隨著在妊娠后期飼糧中25(OH)D3的添加,妊娠母豬血清中SOD、GSH-Px的含量顯著提高，這說(shuō)明25(OH)D3能夠提高妊娠后期母豬的抗氧化酶的含量?；钚匝?ROS)主要包括一系列含氧高反應(yīng)性小分子物質(zhì),如氧陰離子、含氧自由基和過(guò)氧化氫,通常在細(xì)胞內(nèi)短期存在。ROS可以氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等，在氧化應(yīng)激反應(yīng)中,可作為一種重要的信號(hào)分子,相對(duì)過(guò)量的ROS可以打破細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)線粒體功能障礙ADDINNE.Ref.{0B12F794-EF83-4DA3-B1BB-B35BAA7DBF51}(許智等,2020)。前人的一些研究表明ROS與Ca2+有一定的關(guān)系A(chǔ)DDINNE.Ref.{640E63BE-5459-49E2-AB70-1E3CDD9D68F6}(Bogeskietal.,2011;Jungetal.,2017)。過(guò)氧化氫酶(CAT)又被稱為觸酶,是一種重要的抗氧化酶之一，在生物體內(nèi)起防御保護(hù)作用，廣泛存在于各種生物體內(nèi)。同時(shí)也是一種機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一類末端氧化酶，能催化過(guò)氧化氫(H2O2)分解，減少羥自由基(OH)的產(chǎn)生，清除體內(nèi)活性氧物質(zhì)(ROS)，減輕其對(duì)細(xì)胞的損害ADDINNE.Ref.{75A8EB10-A4C6-48E1-8149-0AB5A7BCD8B9}(陳嘉銘等,2019)。而MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量可以間接地反映細(xì)胞的損傷程度。Ca2+被稱為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，其濃度變化可調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能,細(xì)胞Ca2+的穩(wěn)態(tài)與氧化應(yīng)激有一定的聯(lián)系A(chǔ)DDINNE.Ref.{412D0315-8D70-400E-9D3C-BCCAD3BD9D64}(龔麗娟等,2017)。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：隨著在妊娠后期飼糧中鈣含量的降低,妊娠母豬血清中ROS、CAT活性顯著降低；隨著在妊娠后期飼糧中25(OH)D3的添加，血清中ROS的活性顯著降低。而CAT的活性顯著升高;隨著在妊娠后期飼糧中鈣含量的減少和25(OH)D3的添加，血清中MDA的含量無(wú)顯著差異，推測(cè)其原因可能是因?yàn)镃a2+參與呼吸鏈中部分酶的合成。誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生機(jī)體抗氧化水平與Ca2+的攝取量成正相關(guān)。同時(shí)也受到1,25(OH)2D3激素的調(diào)控ADDINNE.Ref.{5F151EA4-C6CD-469E-9755-217B6D5488B0}(Xueetal.,2001)。目前發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3能增加抗氧化酶、解耦連蛋白2(CUP2)、CUP3的表達(dá)ADDINNE.Ref.{485ADCFE-8E0F-4924-9D83-DA67D3FC984D}(Shietal.,2002)。UCP可抑制電子傳遞鏈中電子泄露,降低能量代謝中產(chǎn)生的自由基ADDINNE.Ref.{E56F308E-6476-4CF2-B535-0F221CB1EE27}(Sunetal.,2007)。綜上所述：妊娠后期母豬飼糧中添加25(OH)D3和鈣含量的降低均可顯著提高血清中抗氧化因子SOD、CAT、GSH-Px的含量，降低血液中氧化因子ROS的含量，從而使機(jī)體抗氧化能力得到提高。2.4.6對(duì)血液、乳汁微量元素的影響有研究表明，母乳是營(yíng)養(yǎng)元素結(jié)構(gòu)合理的最佳營(yíng)養(yǎng)品，保護(hù)和促進(jìn)母乳喂養(yǎng)對(duì)新生兒的影響意義重大ADDINNE.Ref.{D40E5998-60C8-4BF6-8CC9-0B84C0FEF064}(苑克華等,2002)。哺乳期是乳汁內(nèi)的微量元素富集要比血液中的微量元素富集程度高。在脯乳期，微量元素的改變受到機(jī)體內(nèi)分泌的影響巨大。當(dāng)機(jī)體處于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充不足時(shí)，會(huì)對(duì)機(jī)體的微量元素的分布有著巨大的改變，微量元素參與人的生長(zhǎng)發(fā)育、內(nèi)分泌、免疫和遺傳生殖等重要生理過(guò)程,是人類健康必不可少的物質(zhì)ADDINNE.Ref.{C5B6D216-3ACF-49E5-BBA3-C64A4E874987}(王巧花,2017)。鈣元素與機(jī)體有著巨大的聯(lián)系，機(jī)體內(nèi)的代謝，骨骼的發(fā)育以及身體代謝狀態(tài)都有著聯(lián)系A(chǔ)DDINNE.Ref.{15DF9A71-7A46-40D9-94B5-7BC775EC168A}(陳國(guó)廣等,2006)。鈣的缺乏可以引起身體的氧化應(yīng)激，機(jī)體處于氧化應(yīng)激條件下，機(jī)體能量的代謝也發(fā)生紊亂。再缺少鈣元素的條件下，機(jī)體為穩(wěn)定機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，激起負(fù)調(diào)節(jié)作用，調(diào)控著鎘、鉻、硒、銅、錳的調(diào)節(jié)。當(dāng)鈣缺乏時(shí)，引起機(jī)體穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化，激起機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，通過(guò)Nrf2的調(diào)節(jié)下，機(jī)體再糖脂代謝發(fā)生變化。并且在缺鈣時(shí)還引起機(jī)體骨骼骨質(zhì)疏松。硒是抗氧化的一種物質(zhì)，可以減少機(jī)體ROS的產(chǎn)生，并且激活GSH減輕機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體處于氧化應(yīng)激是，在負(fù)反饋調(diào)節(jié)下，硒的含量會(huì)耐受性的增加。再機(jī)體大量補(bǔ)充VD時(shí)鉻的含量會(huì)被降低，相反在機(jī)體缺乏VD時(shí)，機(jī)體發(fā)生糖脂代謝紊亂，而鉻的作用可以穩(wěn)定調(diào)節(jié)糖脂代謝。鎘元素的靶器官就是骨和腎臟，處于脯乳期時(shí)乳汁中的鈣來(lái)源主要是骨，當(dāng)機(jī)體缺鈣時(shí)，造成骨質(zhì)疏松，收到二外的鎘損耐受，會(huì)影響后代的對(duì)鈣源的吸收。銅是機(jī)體不可缺少的物質(zhì)，機(jī)體內(nèi)銅存在的形式主要是銅藍(lán)蛋白，和其有關(guān)的酶有三十多種，與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)吸收有很大關(guān)系。本研究表明，乳汁中LCa組和LCa+VD組的銅、鎘、鉻、硒元素的含量顯著高于CON組。LCa組顯著高于LCa+VD組。補(bǔ)充25(OH)D3，可以提高缺鈣時(shí)機(jī)體的微量元素水平，但還是無(wú)法達(dá)到正常水平。2.4.7對(duì)血清中代謝物的影響低鈣日糧對(duì)母豬血清代謝物的影響本試驗(yàn)采用LC-Q-TOF-MS代謝組學(xué)方法篩選出低鈣日糧飼喂母豬后血液中潛在的生物標(biāo)志物，并篩選出相關(guān)代謝通路。CON組與LCa組相比，母豬血清中共有17種物質(zhì)發(fā)生了顯著變化；VD組與LCa+VD組相比，母豬血清中共有19種物質(zhì)發(fā)生了顯著的變化。通過(guò)潛在生物標(biāo)記物韋恩圖對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)其中共有12個(gè)潛在生物標(biāo)記物。之后，對(duì)血清中的差異總代謝物經(jīng)過(guò)代謝通路分析，選擇影響值大于0.1的通路作為潛在靶標(biāo)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是CON組與LCa組相比，甘油磷脂代謝（Glycerophospholipidmetabolism），亞油酸代謝（Linoleicacidmetabolism），α-亞麻酸代謝（alpha-Linolenicacidmetabolism）和糖基磷脂酰肌醇生物合成（Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchorbiosynthesis）這四個(gè)代謝通路均發(fā)生了顯著的變化。圖2.10甘油磷脂代謝Figure2.10Glycerophospholipidmetabolism其中，甘油磷脂代謝通路如圖2.10所示。由LC-MS的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，甘油磷脂代謝途徑中的兩種物質(zhì)（磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）和磷酸乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）發(fā)生了顯著變化。其中包括PE(24:0/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(15:0/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))和PC(22:0/18:3(6Z,9Z,12Z))。PE(24:0/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))是一種磷脂酰乙醇胺。它是一種甘油磷脂，其中磷酸乙醇胺部分占據(jù)一個(gè)甘油取代位點(diǎn)。PC(15:0/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))和PC(22:0/18:3(6Z,9Z,12Z))屬于磷脂酰膽堿。它是一種甘油磷脂，其中磷酸膽堿部分占據(jù)一個(gè)甘油取代位點(diǎn)。磷脂酰膽堿可以有許多不同長(zhǎng)度和飽和度的脂肪酸的不同組合，附著在C-1和C-2位置。含有16、18和20個(gè)碳的脂肪酸是最常見(jiàn)的。甘油磷脂在自然界中普遍存在，是細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層的重要組成部分，并參與代謝和信號(hào)傳導(dǎo)ADDINNE.Ref.{E4C92D6B-2CDA-4F54-8A41-3D14B8EE372B}(Zhangetal.,2009)。同時(shí)，磷脂酰乙醇胺可以和磷脂酰膽堿互相轉(zhuǎn)化。與CON組相比，LCa組母豬血清中PE(24:0/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))、PC(15:0/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))和PC(22:0/18:3(6Z,9Z,12Z))含量均明顯下調(diào)。因此，我們推測(cè)，低鈣日糧母豬體內(nèi)甘油磷脂代謝受到抑制，生物膜代謝速率下降，體內(nèi)的甘油磷脂的產(chǎn)生減少。飼料中添加25(OH)D3對(duì)母豬血清代謝物的影響本試驗(yàn)采用LC-Q-TOF-MS代謝組學(xué)方法篩選出日糧中添加25(OH)D3后，母豬血液中潛在的生物標(biāo)志物，并篩選出相關(guān)代謝通路。VD組與CON組相比，母豬血液中共發(fā)現(xiàn)48種差異代謝物。對(duì)這些差異代謝物通過(guò)代謝通路分析，選擇影響值大于0.1的通路作為潛在靶標(biāo)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有以下7條通路發(fā)生了變化：不飽和脂肪酸生物合成途徑（Biosynthesisofunsaturatedfattyacids），甘油磷脂代謝（Glycerophospholipidmetabolism），花生四烯酸代謝（Arachidonicacidmetabolism），亞油酸代謝（Linoleicacidmetabolism），α-亞麻酸代謝（alpha-Linolenicacidmetabolism），精氨酸生物合成（Argininebiosynthesis），糖基磷脂酰肌醇生物合成（Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchorbiosynthesis）。其中變化最明顯的是甘油磷脂代謝途徑。如圖2.11所示，VD組與CON組相比，甘油磷脂代謝途徑中的三種物質(zhì)（PE、PC和融血磷脂（lysophospholipid，LysoPC））均發(fā)生了顯著的變化。其中，與CON組相比，VD組中屬于PE的PE(24:1(15Z)/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))，PE(18:2(9Z,12Z)/20:0)和PE(24:0/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))均顯著上升；屬于PC的PC(20:3(5Z,8Z,11Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))和PC(22:0/18:3(6Z,9Z,12Z))均顯著上升；屬于LysoPC的LysoPC(17:0)和LysoPC(0:0/18:0)均顯著上升。其中PC和PE均為細(xì)胞膜的主要成分，參與生物膜的合成。最近研究者發(fā)現(xiàn)LysoPC在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)種扮演重要角色。LysoPC可以與G蛋白偶聯(lián)，激活特定的磷脂酶C，釋放二酰基甘油和肌醇三磷酸，從而增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+和激活蛋白激酶CADDINNE.Ref.{D3886C84-7C8A-452A-AE12-EB066F407845}(Lingwoodetal.,2010)。除此之外，它還可以激活細(xì)胞的絲裂原活化蛋白激酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂ADDINNE.Ref.{2137C0BA-CE71-4ED8-9B07-1A7FF17F4C4A}(Sethietal.,2007)。因此，我們推測(cè)，日糧中添加25(OH)D3有助于母豬體內(nèi)甘油磷脂代謝，促進(jìn)了生物膜的代謝。圖2.11甘油磷脂代謝Figure2.11Glycerophospholipidmetabolism低鈣日糧中添加25(OH)D3對(duì)母豬血清代謝物的影響本試驗(yàn)采用LC-Q-TOF-MS代謝組學(xué)方法篩選出低鈣日糧中添加25(OH)D3后，母豬血液中潛在的生物標(biāo)志物，并篩選出相關(guān)代謝通路。LCa組與LCa+VD組相比，母豬血液中共發(fā)現(xiàn)68種差異代謝物。對(duì)這些差異代謝物通過(guò)代謝通路分析，選擇影響值大于0.1的通路作為潛在靶標(biāo)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有以下6條通路發(fā)生了變化：不飽和脂肪酸生物合成途徑（Biosynthesisofunsaturatedfattyacids），鞘脂類代謝（Sphingolipidmetabolism），甘油磷脂代謝（Glycerophospholipidmetabolism），亞油酸代謝（Linoleicacidmetabolism），α-亞麻酸代謝（alpha-Linolenicacidmetabolism）和糖基磷脂酰肌醇生物合成（Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-anchorbiosynthesis）。其中變化最明顯的是甘油磷脂代謝途徑如圖2.12（A）和鞘脂類代謝圖2.12（B）。甘油磷脂代謝途徑中的三種物質(zhì)（PE、PC和LysoPC）均發(fā)生了顯著的變化。與LCa組相比，LCa+VD組中屬于PE的PE(24:0/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))和PE(24:0/20:1(11Z))均顯著上升；屬于PC的PC(o-18:0/24:0)、PC(24:0/20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z))和PC(24:0/16:0)均顯著上升；屬于LysoPC的LysoPC(0:0/18:0)顯著上升。通過(guò)甘油磷脂代謝途徑這三種物質(zhì)的上升，我們推測(cè)，低鈣日糧中添加25(OH)D3有助于母豬體內(nèi)甘油磷脂代謝，促進(jìn)了生物膜的合成。在鞘脂類代謝途徑中，有三種物質(zhì)（乳糖基?；窠?jīng)酰胺（Lactosylceramides，LacCer），半乳糖神經(jīng)酰胺類（Galactosylceramides，GalCer）和鞘磷脂（Sphingomyelin，SM）發(fā)生了顯著變化。乳糖神經(jīng)酰胺是二糖神經(jīng)酰胺中最重要、含量最豐富的一類。它僅在大多數(shù)動(dòng)物組織中少量存在，但具有許多重要的生物學(xué)功能，是大多數(shù)中性寡糖神經(jīng)酰胺、亞砜和神經(jīng)節(jié)苷脂的生物合成前體，具有重要意義。乳糖神經(jīng)酰胺可與腦苷一樣，協(xié)助穩(wěn)定質(zhì)膜和激活特殊微區(qū)或筏內(nèi)的受體分子。它也可能在免疫系統(tǒng)中有自己的特殊功能，因?yàn)樗梢耘c特定的細(xì)菌結(jié)合ADDINNE.Ref.{997ECC68-75EA-4BB6-B16C-BA8EA98014A4}(Stevensetal.,1988)。此外，有研究認(rèn)為，多種促炎因子激活乳糖神經(jīng)酰胺合成酶生成乳糖神經(jīng)酰胺，進(jìn)而激活“氧敏”信號(hào)通路，影響細(xì)胞增殖、粘附、遷移和血管生成等過(guò)程ADDINNE.Ref.{6312B0DC-C4D8-44E1-B748-FEF561CD2138}(Mooreetal.,2003)。半乳糖神經(jīng)酰胺半乳糖神經(jīng)酰胺是腦組織中主要的糖磷脂，故名“腦苷”，存在于所有的神經(jīng)組織中，但它們占灰質(zhì)干重的2%和白質(zhì)干重的12%ADDINNE.Ref.{60453B6A-DEE0-41C4-B94F-A74093B0D4F6}(Lingwoodetal.,2010)?？死疾?也稱為球狀細(xì)胞白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良癥或半乳糖神經(jīng)酰胺脂質(zhì)病)是一種罕見(jiàn)的、通常是致命的退行性疾病，影響神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘?？死疾∈怯苫蛲蛔儗?dǎo)致半乳糖神經(jīng)酰胺酶的缺失造成的?；加锌死疾〉膵雰涸诔錾鷷r(shí)是正常的。癥狀開(kāi)始于3到6個(gè)月之間，表現(xiàn)為易怒、發(fā)燒、肢體僵硬、癲癇、進(jìn)食困難、嘔吐、智力和運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩ADDINNE.Ref.{67C7F5D6-EA7E-4730-BECF-B2957609359A}(Grazianoetal.,2015)。鞘磷脂通常由磷酸膽堿和神經(jīng)酰胺組成，存在于細(xì)胞膜上，尤其是一些神經(jīng)細(xì)胞軸突周圍的膜性髓鞘中。鞘磷脂是唯一不從甘油中人工提取的膜磷脂。細(xì)胞的質(zhì)膜在鞘磷脂中高度富集，主要分布在細(xì)胞膜的胞質(zhì)小葉中。與LCa組相比，LCa+VD組中屬于乳糖基?；窠?jīng)酰胺的LacCer(d18:1/12:0)顯著下降，屬于半乳糖神經(jīng)酰胺類的Galactosylceramide(d18:1/24:1(15Z))顯著上升，屬于鞘磷脂的SM(d18:0/23:0)顯著上升。因此，我們推測(cè)低鈣日糧中添加25(OH)D3增加了母豬鞘磷脂的合成，并且這寫(xiě)鞘磷脂于腦的發(fā)育相關(guān)。血液中的這些代謝物可能通過(guò)臍帶傳遞給胎兒，從而促進(jìn)胎兒的發(fā)育。圖2.12差異代謝通路。（A）甘油磷脂代謝途徑；（B）鞘脂類代謝。Figure2.12Differentialmetabolicpathway.(A)Glycerophospholipidmetabolism;(B)Sphingolipidmetabolism第3章高胎齡母豬飼料中25(OH)D3添加對(duì)胎豬心臟發(fā)育的影響3.1前言在前兩章的內(nèi)容中，已闡述并驗(yàn)證25(OH)D3對(duì)妊娠期間的高胎齡母豬可發(fā)揮出重要的生理作用，改善母豬的生理狀態(tài)并提高其生產(chǎn)性能，在本章節(jié)中，將進(jìn)一步探討25(OH)D3的添加對(duì)胎兒心臟的影響。眾所周知，Ca2+信號(hào)關(guān)乎著機(jī)體內(nèi)各類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與傳遞，更重要的是，在胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，Ca2+信號(hào)是各類器官及其細(xì)胞發(fā)育的基礎(chǔ)ADDINNE.Ref.{D7B51039-2456-4567-A57F-76A55CAE6E77}(Gonzaloetal.,2018)。在胚胎的發(fā)育過(guò)程中，心臟的發(fā)育是非常重要的，心臟在胚胎的形成過(guò)程成熟的較早，且緊密關(guān)乎著腎臟、肝臟及大腦等各類器官的發(fā)育，若心臟發(fā)育受阻或發(fā)育不全，則易造成胎兒先天性心血管疾病、智力缺陷及免疫系統(tǒng)低下等，嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致死胎及流產(chǎn)的發(fā)生。當(dāng)隨著心臟在胚胎時(shí)期的不斷發(fā)育，其形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變使得其泵血功能也逐漸地增強(qiáng)，從而滿足胚胎生長(zhǎng)的生理需求ADDINNE.Ref.{EE496976-DD01-442C-9CCD-5160593D62FB}(唐娟等,2008;Mattiazzietal.,2015)，尤其是在懷孕后期，心瓣膜將形成于心房以及心室的出口處，確保了血液流動(dòng)的方向性，也基本使得胎兒擁有了完整的血液循環(huán)系統(tǒng)。在這一過(guò)程當(dāng)中，心肌細(xì)胞的功能變得完善與成熟，使得細(xì)胞內(nèi)的鈣離子通道對(duì)鈣的吸收及釋放也發(fā)生相應(yīng)的變化，從而影響著心臟的發(fā)育ADDINNE.Ref.{8300542A-E392-4865-8248-20311FCF5321}(張沙沙等,2009;Wullschlegeretal.,2017)。我們已經(jīng)得出結(jié)論：在高胎齡妊娠母豬的飼養(yǎng)過(guò)程中，于日糧中添加適量的25(OH)D3相比傳統(tǒng)的鈣添加具有更好的補(bǔ)鈣效果。然而，目前極少有報(bào)道有關(guān)母體25(OH)D3的補(bǔ)充對(duì)體內(nèi)胎兒發(fā)育的影響，關(guān)于母體25(OH)D3水平對(duì)胎兒心臟發(fā)育的調(diào)控機(jī)制也尚待進(jìn)一步的探索。因此，本研究篩選出健康且營(yíng)養(yǎng)狀況良好的7胎齡母豬40頭，分別設(shè)為4組(n=10)：CON組，LCa組，VD組和LCa+VD組，待母豬生產(chǎn)后隨機(jī)挑選5只新生仔豬并采集其心臟組織。統(tǒng)計(jì)并分析仔豬生產(chǎn)性能的變化；通過(guò)檢測(cè)組織及與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的IGF信號(hào)通路上IGF1、IGF2、IGF1R、IGFBP3及細(xì)胞增殖相關(guān)PCNA和ki67的基因表達(dá)；檢測(cè)血液中相關(guān)生長(zhǎng)因子ACTH、GH、IGF1、IGF2和TSH的含量變化；通過(guò)切片觀察對(duì)比各組仔豬心肌肌纖維的發(fā)育情況。結(jié)合以上技術(shù)，對(duì)高胎齡母豬飼料中25(OH)D3添加對(duì)胎豬心臟發(fā)育的影響進(jìn)行探討。3.2材料與方法3.2.1試驗(yàn)動(dòng)物如前文第2章之2.2.1所述，分組進(jìn)行參與試驗(yàn)。按從四個(gè)母豬分組中，每組隨機(jī)抽取5頭仔豬進(jìn)行采樣試驗(yàn)，共20頭。這些初生仔豬均在出生后2小時(shí)內(nèi)，未采食初乳的情況下實(shí)施安樂(lè)死，對(duì)各組未處死的初生仔豬進(jìn)行生產(chǎn)數(shù)據(jù)記錄與跟蹤。3.2.2樣本的采集與保存初生仔豬在安樂(lè)死前進(jìn)行標(biāo)號(hào)、記錄，死后馬上取出心臟；同時(shí)，測(cè)量心臟、肝臟、腎臟、脾臟、股骨、脛骨、肋骨重量和體重，用于進(jìn)行臟器指數(shù)分析。測(cè)量后解剖心臟樣本，一部分取樣后使用4%多聚甲醛固定；另一部分立即冷凍于液氮中，留待RT-qPCR分析。對(duì)各組其余仔豬在7日齡、14日齡、21日齡（斷奶當(dāng)天）稱量體重，并對(duì)每日狀況進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)測(cè)。3.2.3主要試劑與耗材Trizol、PrimeScriptRTMasterMix為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。2×ChamQSYBRqPCRMasterMix為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品。ELISA測(cè)試試劑盒為上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。3.2.4主要儀器參見(jiàn)表3.1。表3.1主要儀器Table3.1Maininstrument儀器名稱儀器型號(hào)生產(chǎn)廠家組織包埋機(jī)BM-V湖北孝感宏業(yè)電子儀器全自動(dòng)脫水機(jī)TP1020徠卡公司（德國(guó)）切片機(jī)RM2145徠卡公司（德國(guó)）烘片機(jī)HI1220徠卡公司（德國(guó)）冷凍離心機(jī)TDZ5-WS型湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品基因擴(kuò)增儀MyCyclerThermal型美國(guó)Bio-Rad公司微量紫外分光光度計(jì)Nanodrop2000型ThermoFisher科技公司（美國(guó)）吸光光度儀Elx808BLOTECK公司(美國(guó))熒光定量PCR儀LightCycler480型美國(guó)Bio-Rad公司超純水儀Unique-R10型廈門(mén)銳思捷科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品3.2.5組織切片的制作(1)心臟樣本浸泡在4%多聚甲醛溶液中,經(jīng)過(guò)24h固定后,取出樣本修平其上下切面,放入包埋盒中,置于水槽底部,經(jīng)自來(lái)水流水超過(guò)12h,充分去除福爾馬林.(2)連同包埋盒,將其放置在脫水欄內(nèi),考慮到心臟組織較為致密,在脫水上設(shè)置以下步驟：第一步，50%乙醇脫水30min；第二步，70%酒精脫水30min；第三步，80%酒精脫水30min；第四步，90%酒精脫水30min；第五步，95%酒精脫水30min；第六步，100%酒精A脫水20min；第七步，100%酒精Ⅱ脫水20min；第八步，100%酒精與二甲苯的1∶1溶液中浸泡20min，洗脫酒精；第九步，二甲苯A中透明20min；第十步，在二甲苯B中透明20min；第十一步，在二甲苯與石蠟比例為1∶1溶液中浸泡30min；第十二步，在65度低溫石蠟A中浸蠟1h；第十三步，65℃在高溫石蠟與低溫石蠟混合液中再浸蠟1h。(3)取出心臟樣本，切去單側(cè)不平；用包埋機(jī)進(jìn)行石蠟包埋，凝結(jié)后，放入冰箱冷藏在2~8℃條件下保存。(4)設(shè)置切片機(jī)的切片厚度為5μm，將樣本切片，得到4~5μm薄片，經(jīng)過(guò)55℃展片、撈片，將其再烘片機(jī)上，以37℃烘干過(guò)夜約10小時(shí)。(5)蘇木素-伊紅(H.E)染色：55℃烤片1h→浸泡二甲苯Ⅰ脫蠟15min→浸泡二甲苯Ⅱ脫蠟5min→浸泡100%酒精Ⅰ3min→浸泡100%酒精Ⅱ3min→浸泡90%酒精2min→浸泡80%酒精2min→浸泡70%酒精2min→浸泡60%酒精2min→浸泡純水2min→細(xì)胞核用蘇木素染色10min→緩慢自來(lái)水沖洗去除過(guò)染的蘇木精2次→含1%鹽酸的70%酒精分色5~10s→緩慢自來(lái)水流洗浸洗、呈色15min→浸泡60%酒精脫水2min→浸泡70%酒精脫水2min→浸泡80%酒精脫水2min→浸泡90%酒精脫水2min→細(xì)胞質(zhì)酒精伊紅染30s左右→90%和92%酒精兩次分色,各30s→100%酒精Ⅰ脫水/脫色3min→100%酒精Ⅱ脫水/脫色3min→二甲苯Ⅰ透明5min→二甲苯Ⅱ透明15min→晾干→