放線(xiàn)菌掃描電鏡樣品制備方法的篩選

自從威爾遜和davius1成功使用掃描電鏡觀察和研究放線(xiàn)菌以來(lái)，科學(xué)官員對(duì)大量菌株進(jìn)行了檢測(cè)和觀察。改進(jìn)的樣品制備方法和機(jī)器操作方法，使樣品在高放大下具有更高的分辨率。通過(guò)對(duì)不同屬的菌體精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,獲取了一系列與形態(tài)相關(guān)的有用信息,使之一直作為區(qū)分和鑒定種屬的重要手段。放線(xiàn)菌樣品在掃描電鏡進(jìn)行觀察之前,一般都需采用固定、脫水、干燥及表面鍍金等處理［2］。但因放線(xiàn)菌這類(lèi)微生物體積微小,不但收集菌體困難,而且在處理時(shí)大量樣品會(huì)流失,也不能保持微生物生長(zhǎng)的自然狀態(tài)。如何避免制備過(guò)程中的失水、變形、丟失及損傷等問(wèn)題是獲得滿(mǎn)意觀察結(jié)果的關(guān)鍵。從取材來(lái)源到處理方法,都將直接影響觀察效果,初學(xué)者很難把握。本文通過(guò)對(duì)放線(xiàn)菌鏈霉菌掃描電鏡觀察,對(duì)不同的取材來(lái)源、樣品處理方法進(jìn)行比較。同時(shí),對(duì)簡(jiǎn)便快速方法進(jìn)行嘗試,比較和總結(jié)影響放線(xiàn)菌掃描電鏡觀察結(jié)果的主要因素,篩選出簡(jiǎn)便、合適的樣品制備方法進(jìn)行放線(xiàn)菌掃描電鏡觀察,獲得豐富滿(mǎn)意的觀察結(jié)果,同時(shí)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用新的實(shí)驗(yàn)方法提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1scabrusporus135545445555555105105545451010101010101010.5.10.7.4.10.7.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4與16srrna序列的scablusporus鏈霉菌Bn035(Streptomycesscabrisporus),由本實(shí)驗(yàn)室新分離鑒定(16SrRNA序列Genbank登錄號(hào)為KC440853)、高氏1號(hào)培養(yǎng)基斜面4℃保存。1.1.2培養(yǎng)基和試劑PDA培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯20g、葡萄糖2g、瓊脂1.5g、自來(lái)水100mL),PD培養(yǎng)基(不加瓊脂),10%重鉻酸鉀溶液,pH7.2磷酸緩沖液(PBS),3%戊二醛溶液,1%四氧化鋨溶液,0.85%生理鹽水。1.1.3熒光顯微鏡正置顯微鏡MJ-54A高壓蒸汽滅菌鍋,MyCycler580BR恒溫震蕩器,AIRTECHVS-1300L超凈工作臺(tái),OlympuFSX100型正置熒光顯微鏡,EMITECHK-850型臨界點(diǎn)干燥儀,HitachiE-1010型離子濺射儀,TESCAN5136型掃描電子顯微鏡。1.2方法1.2.1培養(yǎng)基pd培養(yǎng)基在無(wú)菌操作條件下,刮取斜面培養(yǎng)的鏈霉菌Bn035孢子少許,制成無(wú)菌懸液。取0.2mL加入含有20mLPD培養(yǎng)基的三角瓶中,180r/min30℃恒溫振蕩培養(yǎng)8d;同時(shí)取上述無(wú)菌懸液0.2mL,涂布于盛有PDA培養(yǎng)基的平皿中,用鑷子將滅菌的蓋玻片以45°夾角插入培養(yǎng)基內(nèi)(每皿3~4片),28℃恒溫培養(yǎng)8d和14d。1.2.2酵母粉添加量的培養(yǎng)將樣品直接用普通顯微鏡高倍鏡鏡檢,確定目標(biāo)的生長(zhǎng)狀況。插片樣品用鑷子取已生長(zhǎng)菌株孢子絲的蓋玻片,將蓋玻片進(jìn)行切割;菌餅樣品用打孔器在固體平皿孢子絲生長(zhǎng)密集處打孔(直徑4mm);發(fā)酵液樣品:吸取培養(yǎng)好的發(fā)酵液0.2mL。將樣品分別放入含有3%戊二醛固定液的1.5mL離心管中固定24h,備用。1.2.3樣品處理方法對(duì)3種取材來(lái)源的待處理樣品分別采用不同固定方法和清洗溶液,對(duì)照CK是將樣品戊二醛和四氧化鋨雙重固定、PBS緩沖液清洗,乙醇梯度脫水,丙酮置換。各樣品具體處理方法見(jiàn)表1。全部處理樣品真空干燥后,用銀導(dǎo)電膠將樣品粘在樣品臺(tái)上,離子濺射儀鍍膜,掃描電子顯微鏡觀察并照相,加速電壓15kV。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)8d發(fā)酵液樣品電鏡觀察從圖1可以看出,培養(yǎng)14d的插片樣品和菌餅樣品及培養(yǎng)8d發(fā)酵液樣品,均可觀察到營(yíng)養(yǎng)菌絲體、氣生菌絲體和孢子絲,孢子絲直生或螺旋狀,說(shuō)明在此時(shí)期將樣品處理用做電鏡觀察適合。2.2分節(jié)細(xì)胞直徑測(cè)定結(jié)果在本試驗(yàn)中,分別取培養(yǎng)8d和14d的菌餅樣品處理觀察,結(jié)果表明菌絲體形態(tài)范圍有明顯區(qū)別。由圖2a(8d)顯示:在這個(gè)時(shí)期,該菌形態(tài)簡(jiǎn)單,主要以營(yíng)養(yǎng)菌絲體為主,菌絲直徑0.5μm左右;由圖2b(14d)顯示,樣品主要以未斷裂的孢子鏈為主,同時(shí)可發(fā)現(xiàn)螺旋孢子鏈,分節(jié)孢子直徑在0.5μm左右。與同樣培養(yǎng)14d的插片樣品進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),插片樣品極易觀察到斷裂但未分散的孢子鏈(見(jiàn)圖2c)。而對(duì)于發(fā)酵液樣品圖2d(8d)進(jìn)行觀察,不易觀察到孢子鏈,孢子散落成片,單個(gè)孢子直徑都在0.5~1μm。從上述4種樣品掃描結(jié)果分析可知,若想獲得同一菌種的最佳觀察效果,必須準(zhǔn)確把握培養(yǎng)時(shí)間,對(duì)于鏈霉菌Bn035來(lái)說(shuō),發(fā)酵液獲得良好形態(tài)的菌體最快,平皿培養(yǎng)的插片樣品次之,平皿培養(yǎng)的菌餅樣品最慢。2.3菌種的生長(zhǎng)形態(tài)插片樣品獲得的菌體圖像背景簡(jiǎn)單,結(jié)構(gòu)清晰,層次分明,很少有雜物干擾;菌絲和孢子排列整齊,形態(tài)正常,分散度好,孢子鏈延展,帶有螺旋狀;孢子呈圓柱形,表面褶皺(見(jiàn)圖3a1,3a2)。菌餅樣品中菌絲和孢子堆砌在一起,相互交叉重疊;部分菌絲和孢子被培養(yǎng)基或分泌物覆蓋,要觀察的部位未充分暴露,但仍可少量觀察到未分節(jié)的氣生菌絲體、螺旋孢子鏈和散落的孢子(見(jiàn)圖3b1,3b2)。發(fā)酵液獲得的菌體,真實(shí)地展現(xiàn)了菌絲自然生長(zhǎng)的形態(tài)結(jié)構(gòu),大量單個(gè)孢子附著在菌絲上,或散落在培養(yǎng)基上,呈橢圓形,光澤、飽滿(mǎn)、充滿(mǎn)活力,立體感強(qiáng);但無(wú)明顯孢子鏈,菌絲表面有大量附著物(見(jiàn)圖3c1,3c2)。2.4菌餅樣品的測(cè)定在圖4中,經(jīng)戊二醛和四氧化鋨雙重固定的菌餅樣品與戊二醛單固定、未經(jīng)任何固定處理直接干燥噴金的菌餅樣品比較,雙固定和單固定樣品無(wú)明顯差異,均能真實(shí)、完整地反映樣品的形態(tài)和結(jié)構(gòu),菌絲飽滿(mǎn),表面光滑,無(wú)明顯皺縮和變形(見(jiàn)圖4a,4b);未經(jīng)任何固定處理直接干燥噴金的菌餅樣品孢子鏈明顯,但有部分菌絲和孢子皺縮變形(見(jiàn)圖4c)。2.5發(fā)酵液樣品的清洗由圖5可知,菌餅樣品在不同清洗方法處理后有明顯差異,用生理鹽水清洗后,有部分樣品被埋沒(méi)(見(jiàn)圖5b1~5b3)。發(fā)酵液樣品通過(guò)不同清洗方法處理,生理鹽水清洗后的孢子表面干凈、光滑,PBS和蒸餾水清洗的樣品在干燥后,菌絲和孢子周?chē)蟹置谖?見(jiàn)圖5c1~5c3)。插片樣品在固定后,通過(guò)磷酸緩沖液、生理鹽水或蒸餾水清洗的樣品,孢子表面無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖5a1~5a3)。2.6發(fā)酵液樣品測(cè)定在圖6中,菌餅樣品的菌絲和孢子經(jīng)乙醇或丙酮脫水,孢子皺縮明顯(見(jiàn)圖6a1,6a2)。發(fā)酵液樣品經(jīng)乙醇或丙酮脫水,結(jié)果無(wú)明顯區(qū)別,菌絲和孢子光滑、飽滿(mǎn)(見(jiàn)圖6b1,6b2)。插片樣品經(jīng)乙醇或丙酮脫水,菌絲和孢子表面無(wú)明顯皺縮(見(jiàn)圖6c1,6c2)。3不同分析方法對(duì)于樣品制備的影響Tresner等［3］利用電子顯微鏡鑒別鏈霉菌菌種,以孢子鏈的形態(tài)、孢子表面結(jié)構(gòu)、孢子囊形狀、單個(gè)孢子的構(gòu)成、孢子表面的裝飾物如光滑、凸起、褶皺、多刺等作為區(qū)別特征,這些特征即使在今天的放線(xiàn)菌分類(lèi)學(xué)中也仍然十分重要。因此,孢子表面的裝飾物是一種重要的分類(lèi)學(xué)特征,觀察到這種特征的變化以及孢子鏈的形態(tài)對(duì)于區(qū)分鏈霉菌屬內(nèi)各個(gè)種是很重要的［4］。掃描電鏡觀察需要各種形態(tài)的菌絲和孢子,而拍攝這類(lèi)照片,樣品制備是關(guān)鍵。本研究通過(guò)對(duì)不同取材來(lái)源和不同處理方式的樣品進(jìn)行觀察,其結(jié)果進(jìn)一步證實(shí):通過(guò)合適的培養(yǎng)時(shí)間和取樣方法才容易在一個(gè)樣品中觀察到各主要時(shí)期整體孢子鏈的豐富形態(tài)細(xì)節(jié)。另外,先在光鏡下選取菌絲分散、孢子絲多的樣品進(jìn)行固定,節(jié)省了時(shí)間,觀察效果好。目前,掃描電鏡樣品制備過(guò)程從固定到濺射鍍膜要花掉一整天時(shí)間,并且需要先進(jìn)的技術(shù)及專(zhuān)業(yè)知識(shí),給放線(xiàn)菌電鏡樣品制備增加了一定的困難。本研究與常規(guī)掃描電鏡制樣方法比較,探究不同固定、清洗和脫水處理過(guò)程對(duì)放線(xiàn)菌掃描觀察結(jié)果產(chǎn)生何種影響,結(jié)果表明不同固定、清洗、脫水處理過(guò)程影響了樣品照片的清晰度和菌體數(shù)量。有研究報(bào)道蒸餾水、PBS滴在玻片上,干燥后蒸餾水無(wú)雜質(zhì)殘留,PBS干燥后留下了顆粒層;用水清洗樣品后無(wú)雜質(zhì)覆蓋;用戊二醛固定后不清洗,干燥后有留下一層細(xì)微顆粒膜覆蓋遮蔽樣品［5，6］,與本研究結(jié)果一致。因此,結(jié)合本研究結(jié)果,建議樣品如果經(jīng)過(guò)固定后,要用蒸餾水或乙醇、丙酮等干燥后無(wú)殘留的試劑清洗,但乙醇、丙酮會(huì)使樣品收縮,用蒸餾水清洗經(jīng)濟(jì)又方便。另有文獻(xiàn)報(bào)道［7］,在放線(xiàn)菌制樣過(guò)程中不固定,省去清洗和脫