FSHR基因多態(tài)性與不孕婦女卵巢反應相關性研究摘要：目的探討卵泡刺激素受體(FSHR)基因680位點單核苷酸多態(tài)性對IVF-ET患者卵巢反應性和妊娠結局的影響。方法選取通過體外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕的患者120例，其中卵巢低反應和高反應患者各30例，卵巢反應正?；颊?0例，

通過直接測序來檢測FSHR基因680外顯子的多態(tài)性，根據(jù)檢測結果分為NN組、NS組及SS組，對3組間卵巢反應和移植后臨床結局進行比較。結果SS純合型患者基礎FSH水平為顯著高于NN和NS型(P<0.05)，NN型患者獲卵數(shù)顯著高于SS型(P<0.05)，三組患者間臨床妊娠率未呈現(xiàn)顯著性差異。結論680位點SS基因型可能會引起患者卵巢在促排卵過程中反應性過低，本研究未發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性對臨床妊娠率的影響。關鍵詞：體外受精-胚胎移植；卵泡刺激素受體；基因多態(tài)性；卵巢反應性RelationshipbetweengenepolymorphismsoffolliclestimulatinghormonereceptorandovarianresponseonovarianresponseduringcontrolledovarianhyperstimulatonAbstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofpolymorphismatposition680offolliclestimulatinghormonereceptor(FSHR)geneonovarianresponseandpregnancyoutcome.MethodsAtotalof120patientsundergoinginvitrofertilization-embryotransfer(IVF-ET)wereselected,including30patientswithlowovarianresponse,30patientswithhighovarianresponseand60patientswithnormalovarianresponse.TheAsn680SerofFSHRwasamplifiedbyDNAfragmentsweresequencedtodeterminethegenotypeofFSHR．ThewomenweredividedintothreegroupsaccordingtotheresultsofAsn680Ser,andtheovarianresponseandpregnancyoutcomewerecomparedbetweenthethreegroups.ResultsThebasicFSHlevelofSSgroupwassignificantlyhigherthanthatofNNgroupandNSgroup(P<0.05).ThenumberofretrievedoocyteswasmoreinNNgroupthaninSSgroup(P<0.05).Therewasnosignificantdifferenceinclinicalpregnancyratesamongthethreegroups.ConclusionTheSSgenotypeof680FSHRgenemayberelatedtolowovarianresponse.Thegenepolymorphismsdonotseemtoinfluencepregnancyrate.Keywords：Invitrofertilization-embryotransfer;Folliclestimulatinghormonereceptor;Genepolymorphisms;Ovarianresponse卵泡刺激素(FSH)作為體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療時控制性超促排卵藥物一直被廣泛使用，適量的FSH是獲得多個成熟卵泡并最終實現(xiàn)胚胎移植成功的基礎。為了實現(xiàn)超促排卵過程中FSH使用劑量的精準定量，目前針對卵巢反應性預測指標的研究已經(jīng)越發(fā)受到關注，隨著遺傳學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)卵泡刺激素受體（FSHR)基因單核苷酸多態(tài)性可能會影響卵巢對FSH刺激的反應性[1]。本研究將對FSHR基因680位點多態(tài)性變化是否會影響卵巢反應性以及移植后的臨床結局作一探討。1資料與方法研究對象選取2018年5月至2019年11月金華市人民醫(yī)院生殖中心行IVF-ET的患者120例。納入標準：①年齡≤35歲；②不孕原因為輸卵管及(或)男方因素、不明原因者；③月經(jīng)第2天FSH<10U/L。排除標準：除外子宮內膜異位癥、多囊卵巢綜合征、有卵巢或/和輸卵管手術史。研究分組根據(jù)《實用人類輔助生殖技術》中卵巢反應性的分級方法，將患者分為3組：獲卵數(shù)≤4個者為卵巢低反應組（30例）；獲卵數(shù)5-14個者分為卵巢正常反應組（60例）；獲卵數(shù)≥15個者為卵巢高反應組（30例）[2]。1.3實驗方法1.3.1控制性促排卵方案所篩選患者根據(jù)年齡、AFC及基礎內分泌等統(tǒng)一進行長方案降調節(jié)，在治療周期前的黃體中期（月經(jīng)21天或者基礎體溫BBT上升第7天)開始皮內注射促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa），在治療周期第3天開始每日肌注rFSH（果納芬Gonal-F），常規(guī)促排卵。治療周期第８天通過Ｂ超監(jiān)測卵泡大小，當顯示最大卵泡直徑達18mm或有3個卵泡平均直徑達17mm時中止rFSH注射，肌注人絨毛膜促性腺激素（HCG）10000IU，于34-36h后陰道超聲引導下穿刺取卵。1.3.2外周血DNA提取分別采集患者外周靜脈血5mL，以5mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)100μL抗凝，置于-80℃冰箱凍存待用。患者基因組DNA用DNA提取試劑盒提取后置于-20℃保存。1.3.3FSHR基因680位點基因型檢測按Primerpremier5.0軟件對FSHR基因10號外顯子進行擴增引物的設計。含蓋Asn680Ser的上游引物序列：5'-TTTGTGGTCATCTGTGGCTGC-3'，下游引物：5'-CAAAGGCAAGGACTGAATTATCATT-3'；PCR反應體系為25μL，分別為12.5μLTaqPCRMastermix，上游和下游引物（10μM）各0.5μL，DNA模板200ng，補充ddH2O至25μL。擴增技術條件：95℃預變性3min，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，進行35個循環(huán)后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，最后在紫外燈下對擴增結果進行觀察，然后將PCR產(chǎn)物純化并測序。1.4統(tǒng)計學方法運用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)用x±s表示，組間計量資料比較使用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義；組間基因型頻率及等位基因頻率的差異比較采用卡方檢驗，多組間兩兩比較使用Bonferroni方法來校正檢驗水平，降低犯第一類錯誤的風險，以P<0.05/n（n為比較次數(shù)，本研究n=3，P<0.0167）為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1FSHR基因680位點基因型及等位基因分布情況高反應組與正常反應組間NN、NS和SS三種基因型和等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinburg平衡（P>0.05），低反應組NN基因型頻率比正常反應組和高反應組要低，但三組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.0167）；SS基因型頻率則顯著高于另外兩組（P<0.0167）。等位基因N、S分布頻率在三組間分布呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05），其中低反應組等位基因N分布顯著低于另外兩組，等位基因S分布頻率顯著高于另外兩組（P<0.0167）。表1各組間FSHR基因680位點基因型及等位基因分布情況（%)組別例數(shù)基因型等位基因NNNSSSNS高反應組3016(53.3)11(36.7)3(10.0)43(71.7)17(28.3)低反應組307(23.3)9(30.0)14(46.7)*23(38.3)*37(61.7)*正常反應組6029(48.3)21(35.0)10(16.7)#79(65.8)#41(34.2)#χ2值-6.7190.33313.90716.88316.883P值-0.0350.8460.001<0.001<0.001注：與高反應組相比，*為P<0.0167（Bonferroni校正）；與低反應組相比，#為P<0.0167（Bonferroni校正）。2.2FSHR基因680位點各基因型組間臨床資料和卵巢反應性相關指標比較NN、NS及SS基因型組在年齡、BMI、hCG注射日E2水平、竇卵泡數(shù)、Gn使用天數(shù)Gn用量、受精率、卵裂率及妊娠率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。SS型患者bFSH水平顯著增高于NN組及SS組(P<0.05)，SS型患者獲卵數(shù)顯著低于NN型和NS型(P<0.05)。見表2。表2各基因型組間臨床資料和卵巢反應性比較相關指標NN(n=52）NS(n=41）SS(n=27）F/χ2值P值年齡(歲)29.9±3.130.1±3.730.5±3.10.2570.774BMI(kg/m2）21.5±2.321.2±2.321.4±2.60.1390.870bFSH（IU/L）7.3±1.77.1±1.88.3±1.4*#4.9020.009HCG日E2（ng/L）4555±11524368±10484564±11290.3970.673竇卵泡數(shù)（AFC）(個)12.2±5.511.9±5.810.6±3.70.8230.442獲卵數(shù)（枚）10.9±5.79.9±5.67.4±5.4*3.7410.027Gn使用天數(shù)（d）10.8±1.710.5±2.110.9±2.10.3780.686Gn總用量（IU）2566±7992531±9332618±8140.0840.919受精率（%）79.3（453/571）78.4(319/407)74.4(148/199）2.1460.342卵裂率（%）93.4（423/453）92.5（295/319）88.5（131/148）3.7320.155臨床妊娠率（%）51.9（27/52）48.8（20/41）44.4（12/27）0.4010.818注：與NN比較，*為P<0.05；與NS比較，#為P<0.05。3討論卵泡刺激素（FSH）作為一種糖蛋白激素，產(chǎn)生于腺垂體中，通過在性腺中與其同源受體-卵泡刺激素受體（FSHR）結合并相互作用，能夠對卵子成熟和精子的生成產(chǎn)生間接影響，該促性腺激素在控制性腺功能和生殖中起關鍵作用,對FSHR基因的研究過程中發(fā)現(xiàn)其突變能夠明顯的影響卵泡成熟及精子生成[3]。由于FSH在卵泡發(fā)育和卵巢及卵巢顆粒細胞類固醇激素生成中的關鍵作用，因此FSH受體基因的突變可能會影響生育能力，尤其是女性[4]。FSHR基因的突變導致相關功能失活可能會引起患者卵巢早衰，原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)，不育[5]。但由于FSHR基因突變在自然界的發(fā)生率很低，其基因多態(tài)性卻廣泛存在，有研究發(fā)現(xiàn)FSHR基因多態(tài)性可能影響受體活性，從而表現(xiàn)出卵巢功能的差異性[3，4]。FSHR基因相對分子量介于75至76.5kDa之間，作為G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，由678個氨基酸組成，分為7個跨膜結構域,FSHR基因結構包含10個外顯子和9個內含子，定位于２號染色體短臂２區(qū)１帶(2p21)[6]。據(jù)報道，F(xiàn)SHR基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)存在較為廣泛，到目前為止，已有超過900個SNP，目前人們所熟知的兩個位點分別是Asn680Ser和Ala307Thr[7]，其中對680位點基因多態(tài)性研究較多，發(fā)現(xiàn)在不同人群中680位點三種基因型（NN\NS\SS）分布存在差異，Rai等[8]對106名印度裔不育婦女的研究顯示，NN、NS和SS三種基因型分布頻率依次為9.4%、47.2%、43.4，Jun等[1]對263名40歲以下韓國婦女的的研究顯示以上三種基因型相關頻率分別為45.6%，41.8%和12.5%。本研究中NN、NS、SS基因型分布頻率分別43.3%、34.2%、22.5%，提示FSHR基因680位點多態(tài)性的分布可能存在人種或地域性差異。FSHR基因680位點多態(tài)性影響FSHR生物學功能的確切機制還不清楚。目前認為存在于FSHR蛋白羧基末端的大量Ser和Thr殘基是磷酸化反應的潛在作用底物，Ser殘基與磷酸化有關，而Asn殘基則能引起糖基化保守序列的產(chǎn)生,可能對受體蛋白的翻譯后加工以及細胞表面表達起重要作用[10]。因此羧基末端氨基酸的更替會削弱生物信號的傳遞并降低受體與配體之間的結合力，結果導致FSHR生物學活性降低，引起血清FSH水平增高和卵巢反應不良[11]。國內外對680位點多態(tài)性與卵巢反應方面的研究較多，雖然最終結論不盡相同，但多數(shù)均發(fā)現(xiàn)血清bFSH在SS組呈現(xiàn)較高水平，而血清bFSH上升通常表明卵巢儲備下降,因此對外源性促性腺激素(Gn)的刺激呈現(xiàn)反應過低，促排卵時需要更多的外源性Gn，提示SS基因型可能與卵巢低反應有關[8,9,12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)SS組bFSH水平均明顯高于NN組和NS組(P<0.05)，卵巢低反應組SS基因型頻率和S等位基因頻率也顯著高于高反應組和正常反應組，推測SS基因型患者FSHR生物活性上可能發(fā)生了改變從而降低了卵巢對外源性Gn刺激的敏感性。在實驗室指標和妊娠結局方面，SS組獲卵數(shù)明顯低于NN組，也許是SS組卵巢低反應影響所致，但三組間妊娠率差異并未呈現(xiàn)統(tǒng)計學意義，此前也有報道未發(fā)現(xiàn)680位點多態(tài)性與妊娠率的相關性[12-14]，但Jun等的研究表明NN型患者的臨床妊娠率顯著高于另外兩組，此外Klinkert等[15]的研究結果表明SS型患者的著床率和妊娠率是NN型的3倍，可見FSHR基因多態(tài)性與妊娠結局的相關性上尚存在爭議，表明最終妊娠是否成功應該是多方面因素共同作用的結果。如何正確預測卵巢反應性已越來越受到國內外的廣泛關注，目前對FSHR基因單核苷酸多態(tài)性與卵巢相關功能的研究也呈日益增多的趨勢，本研究表明FSHR基因680位點SS基因型可能與卵巢低反應相關，但限于樣本量太小和地區(qū)人種差異影響，尚需進一步研究加以證實。參考文獻[1]JunJK,YoonJS,KuSY,etal.Follicle-stimulatinghormonereceptorgenepolymorphismandovarianresponsestocontrolledovarianhyperstimulationforIVF-ET[J].JHumGenet.2006,51(8):665-670.[2]黃荷鳳.實用人類輔助生殖技術[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2018:217-218.[3]IlgazNS,AydosOS,KaradagA,etal.Impactoffollicle-stimulatinghormonereceptorvariantsinfemaleinfertility[J].JAssistReprodGenet,2015,32(11):1659-1668.[4]AtabiekovI,HobeikaE,SheikhU,etal.Theroleofgenetherapyinprematureovarianinsufficiencymanagement[J].Biomedicines,2018,6(4):102.[5]ZilaitieneB,DirzauskasM,VerkauskieneR,etal.TheimpactofFSHreceptorpolymorphismontime-to-pregnancy:Across-sectionalsingle-centrestudy[J].BMCPregnancyChildbirth,2018,18(1):272.[6]Ulloa-AguirreA,Zari?ánT,Jardón-ValadezE,etal.Structure-functionrelationshipsofthefollicle-stimulatinghormonereceptor[J].FrontEndocrinol(Lausanne),2018,9:707.[7]SimoniM,CasariniL.Mechanismsinendocrinology:GeneticsofFSHaction:a2014-and-beyondview[J].EurJEndocrinol,2014,170(3):91-107.[8]RaiS,Ashish,KumariP,etal.Correlationoffollicle-stimulatinghormonereceptorgeneAsn680Ser(rs6166)polymorphismwithfemaleinfertility[J].JFamilyMedPrimCare,2019,8(10):3356-3361.[9]SzymańskaK,Ka?afutJ,Rivero-MüllerA.Thegonadotropinsystem,lessonsfromanimalmodelsandclinicalcases[J].MinervaGinecol,2018,70(5):561-587.[10]HeWB,DuJ,YangXW,etal.Novelinactiva