第二章細胞生物學研究方法第一節(jié)細胞形態(tài)結構的觀察方法一、光學顯微鏡技術二、電子顯微鏡技術三、掃描隧道顯微鏡光學顯微鏡技術基本參數(shù)分辨率R=0.61λ/N．A放大率1.構成：①照明系統(tǒng)②光學放大系統(tǒng)③機械裝置2.原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡放大成虛像。普通光學顯微鏡介紹光路圖Figure9-11aMolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)腎的尿道橫切面，用蘇木精-伊紅染色Figure9-11bMolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)植物根橫切面，番紅──快綠染色Figure9-14MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)幾種特殊的光學顯微鏡相差顯微鏡技術把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處。1.環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。2.相位板（annularphaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標本

倒置顯微鏡物鏡與照明系統(tǒng)顛倒；用于觀察培養(yǎng)的活細胞，通常具有相差或DIC物鏡，有的還具有熒光裝置。

干涉顯微鏡

（DIC）1952年Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果，能顯示結構的三維立體投影。標本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。

暗視野顯微鏡聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野背景是黑的，物體邊緣是亮的?？捎^察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。熒光顯微鏡特點：光源為短波光；有兩個特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。Figure9-14MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)圖中,DNA為藍色，微管為綠色用于觀察能激發(fā)出熒光的結構。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。Figure9-15MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)細胞有絲分裂,DNA為藍色，微管為綠色，中心體為紅色2023/10/1619熒光顯微鏡FluorescenceMicroscopy熒光共振能量轉移(FRET)Figure9-18MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)激光共聚焦掃描顯微境

用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。能顯示細胞樣品的立體結構。分辨力是普通光學顯微鏡的3倍。用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/2023/10/1623Slide40x活細胞圖像4－維分析激光共焦顯微鏡

LSCM2023/10/1624活細胞內(nèi)分子圖像追蹤電子顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡透射電子顯微鏡以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構成。分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達百萬倍。用于觀察超微結構（小于0.2μm）。20世紀60年代問世，用來觀察標本表面結構。分辨力為6~10nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。掃描電子顯微鏡人類紅細胞掃描隧道顯微鏡

原理：根據(jù)隧道效應設計，當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關系，將掃描過程中電流的變化轉換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向為0.1~0.2nm，縱向可達0.001nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質均可進行觀察。FluorescenceResonanceEnergyTransfer，F(xiàn)RET

FRET技術是檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具，可以檢測某一細胞中兩個蛋白是否存在直接的相互作用

FluorescenceRecoveryAfterPhotobleaching，F(xiàn)RAP

熒光漂白恢復原理:利用高能量激光束的照射使特定的區(qū)域的熒光發(fā)生不可逆的淬滅，通過非漂白區(qū)的熒光標記分子在膜上或胞漿中運動至光漂白區(qū)來完成光漂白區(qū)熒光的恢復。FRAP可以用于解決活細胞內(nèi)包括蛋白定位，動力學以及與其他成分相互作用等一系列問題。

Freeze–EtchingFracture冷凍蝕刻Freeze–Fracture

andEtching

Replication冷凍斷裂蝕刻復型第二節(jié)細胞組分的分析方法一、用超速離心技術分離細胞器與生物大分子及其復合物二、細胞內(nèi)生物大分子的示蹤技術、原位雜交三、應用放射自顯影技術研究生物大分子在細胞內(nèi)的合成動態(tài)四、流式細胞技術、技術進展和功能離心技術差速離心密度梯度離心

——速度密度梯度離心

——等密度梯度離心SubsequentpurificationbyDensity-GradientEquilibriumCentrifugationIsolation,purification,andfractionationofproteinsSelectivePrecipitation

(ammoniumsulfate)LiquidColumnChromatography（柱層析）

Ion-exchangeChromatographyGelFiltrationChromatography又稱排阻層析或分子篩方法：交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)

AffinityChromatographyP