第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一.光學(xué)顯微鏡技術(shù)（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡1.介紹幾個(gè)概念分辨率：區(qū)分兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離.

反差：指顯微鏡觀察物體時(shí)，物體和周圍介質(zhì)明暗對比差異.2.普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)光學(xué)放大系統(tǒng)：由目鏡和物鏡兩組玻璃透鏡構(gòu)成照明系統(tǒng)：光源、折光鏡、聚光鏡機(jī)械和支架系統(tǒng)（二）相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)1.相差顯微鏡的結(jié)構(gòu)1）環(huán)形光闌（annulardiaphragm）：由大小不同的孔環(huán)成的光闌。它位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。2）相位板（annularphaseplate）：與物鏡相適應(yīng)的圓環(huán)，涂有氟化鎂等電解質(zhì)，位于物鏡后焦面，它可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：（1）A+相板(凸)：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成明反差（或稱負(fù)反差）。（2）B+相板（凹）：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。3）合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡：用于調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面完全吻合。

2.相差顯微鏡的原理1）介紹有關(guān)概念相位:指某一時(shí)刻，光波動(dòng)所達(dá)到的位置。相差：指同一光線經(jīng)過折射率不同的介質(zhì)，其相位發(fā)生的差異。衍射：波的傳播超出了波束的幾何范圍并發(fā)生能留的重新分布；干涉:當(dāng)直射光和衍射光相遇，根據(jù)它們的相位異同，其振幅發(fā)生減小或加大的變化，光線變暗或變亮的現(xiàn)象。

相長干涉：直射光與衍射光同相位，干涉而形成的合波的振幅等于直射光與衍射光振幅之和。

相消干涉：衍射光與直射光相位差λ/2,干涉而形成的合波的振幅等于直射光與衍射光振幅之差。

2）相差顯微鏡原理運(yùn)用一些特殊裝置,使通過被檢物體的光線分離成兩組光,并人為使兩組光波之間的微弱的相位加大,再經(jīng)干涉作用,使相位差變?yōu)檎穹?反差增強(qiáng),從而觀察被檢物及細(xì)微結(jié)構(gòu).(三)熒光顯微鏡

熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。

(四)激光掃描共聚焦顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscope，LSCM)：利用激光點(diǎn)作為熒光的激發(fā)光，通過掃描裝置對標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)掃描，并通過空間共軛光闌（針孔）阻擋焦平面以外光線而成像的一種顯微鏡。是當(dāng)今世界最先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器。1.激光掃描共聚焦顯微鏡基本原理:

傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場光源，標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射或散射光的干擾；激光掃描共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對標(biāo)本內(nèi)焦平面的每一點(diǎn)掃描，標(biāo)本上的被照射點(diǎn)，在探測針孔處成像，由探測針孔后的光點(diǎn)倍增管（PMT）或冷電耦器件（cCCD）逐點(diǎn)或逐線接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像,經(jīng)逐點(diǎn)掃描后才形成整個(gè)標(biāo)本的光學(xué)切片（Opticsection）。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和探測針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測針孔處成像，這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點(diǎn)。激光共聚焦的工作原理簡單表達(dá)就是它采用激光為光源，在傳統(tǒng)熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上，附加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計(jì)算機(jī)控制來進(jìn)行數(shù)字化圖像采集和處理的系統(tǒng)。2.激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用完成對活細(xì)胞和組織或切片進(jìn)行連續(xù)掃描，獲得精細(xì)的單個(gè)細(xì)胞或一群細(xì)胞的各個(gè)層面結(jié)構(gòu)三維圖像。利用熒光標(biāo)記，測定細(xì)胞內(nèi)如鈉、鈣、鎂、PH等離子濃度的比率及動(dòng)態(tài)變化；具備光刺激掃描單元，實(shí)現(xiàn)熒光壽命的熒光衰減分析（FLIP）和熒光漂白后恢復(fù)（FRAP）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析（FRET）的應(yīng)用；同時(shí)可以做多重?zé)晒鈽?biāo)記信號檢測；利用熒光標(biāo)記測定活體細(xì)胞內(nèi)如鈉、鈣、鎂、PH等離子濃度的比率及動(dòng)態(tài)變化。能對信號進(jìn)行快速和精確的定位、定時(shí)和定位分布的觀察；進(jìn)行細(xì)胞損傷、熒光光漂白及恢復(fù)技術(shù)（FRAP）、熒光共振能量轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)（FRET）、）等光刺激（光漂白）實(shí)驗(yàn)、方便進(jìn)行細(xì)胞間通訊研究；完成圖像分析和3D重構(gòu)等分析?？蛇M(jìn)行發(fā)射光譜掃描取圖，對于重疊光譜進(jìn)行拆分，實(shí)現(xiàn)熒光共定位的應(yīng)用；二.電子顯微鏡電子顯微鏡（electronmicroscope）是根據(jù)電子光學(xué)原理，用電子束和電子透鏡代替光束和光學(xué)透鏡，使物質(zhì)的細(xì)微結(jié)構(gòu)在非常高的放大倍數(shù)下成像的儀器.(一)電鏡與光鏡的比較1.光源的比較2.透鏡的比較光學(xué)玻璃透鏡電子透鏡3真空度的比較4.觀察系統(tǒng)的比較

電鏡需要把電子流轉(zhuǎn)換成可見光的裝置

類型

光源

分辨率光鏡可見光（3900-7600?

）紫外光（2000?

）2000?

1000?

電鏡～0.1～數(shù)?0.2～1?

電鏡與光鏡的比較顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9nm）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差（二）電子顯微鏡成像原理原理:在真空條件下,電子束經(jīng)高壓加速后,穿透樣品時(shí)形成散射電子和透射電子,它們在電磁透鏡的作用下在熒光屏上成像。（三）電子顯微鏡的基本構(gòu)造透射電鏡(Transmissionelectronmicroscope

)1.電子束照明系統(tǒng)2.成像系統(tǒng)3.真空系統(tǒng)4.記錄系統(tǒng)掃描電鏡及其成像（四）主要電鏡制樣技術(shù)1.超薄切片技術(shù)

超薄切片（ultrathinsection）：用于透射電鏡觀察的極薄標(biāo)本切片，厚約40-50nm.通常標(biāo)本用樹脂包埋，用超薄切片機(jī)制備。

2.負(fù)染色技術(shù)負(fù)染色技術(shù)（negativestaning）：一種制備電子顯微鏡樣品圖像呈現(xiàn)負(fù)反差的技術(shù)。

第二節(jié)細(xì)胞及其組分的分析方法一.超離心技術(shù)超離心（ultracentrifugation）：根據(jù)物質(zhì)沉降系數(shù)、質(zhì)量、浮力因子等不同，應(yīng)用強(qiáng)大的離心力使物質(zhì)分離、濃縮提純的方法。差速離心:不同離心速度產(chǎn)生不同離心力,將組分分開。密度梯度離心:將樣品放在密度逐漸增加的、形成密梯度的的、高溶解性、惰性物質(zhì)溶劑（液）表面，在離心力作用下，不同的組分以不同的沉降速率沉降，形成不同的沉降帶。速度沉降：密度相近而大小不一的細(xì)胞組分。（組分的形狀和大?。┑让芏瘸两担好芏炔煌Q浮力密度。（不依賴與大小和形狀）二.細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法為測定蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂質(zhì)等細(xì)胞組分，通常利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊集團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和相對含量。

孚爾根（Feulgenreaction，F(xiàn)R）:顯示DNA在細(xì)胞中的分布

PAS：多糖在細(xì)胞中的分布米倫反應(yīng)（Millonreaction）:蛋白測定脂肪酸的細(xì)胞化學(xué)測定酶的細(xì)胞化學(xué)測定三.特異蛋白抗原的定位和定性（一）免疫熒光技術(shù)免疫熒光（Immunofluorescencetechnique

）：指將免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合用于研究特異性抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。實(shí)驗(yàn)主要步驟：熒光抗體的制備、標(biāo)本處理、觀察記錄等.