Chapter5VectorWellcometoGeneticEngineering

ByNieguangjun

E-mail:n.g.jason@163.com什么叫載體？哪些材料可以作為載體？為什么？載體的分類，以及不同類型載體間的區(qū)別？載體的總論質(zhì)粒載體噬菌體載體人工載體本章主要內(nèi)容載體的總論載體的定義載體的條件載體的分類載體的來源及其特征本節(jié)主要內(nèi)容載體（vector）是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的ＤＮＡ分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過實(shí)驗(yàn)手段可使其它的ＤＮＡ片段連接在它的上面，而進(jìn)行復(fù)制。What?作為基因工程的載體，具備幾個(gè)性能：載體的條件NecessaryconditionsforgeneralvectorNecessaryconditionsforperfectvector分子較小，可攜帶比較大的ＤＮＡ片段。能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)multiplecloningsites，MCS）。有適合的標(biāo)記，易于選擇。有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。NecessaryconditionsforgeneralvectorNecessaryconditionsforperfectvector具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷后仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞;低分子量的質(zhì)粒對(duì)限制酶具有多重識(shí)別位點(diǎn)的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因理想的選擇性的標(biāo)記；根據(jù)需要，加載一些特殊的元件；具有較大選擇空間的MCS。Classificationbyfunction克隆載體:

克隆一個(gè)基因或DNA片斷表達(dá)載體:用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體:把一個(gè)基因插入到染色體組中載體的來源質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體真核細(xì)胞克隆載體質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體〉1000kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒不同種類載體的特征二、質(zhì)粒載體質(zhì)粒簡(jiǎn)介質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型表達(dá)型質(zhì)粒載體重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體其他重要的質(zhì)粒載體本節(jié)主要內(nèi)容質(zhì)粒的定義質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒的分離與純化影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素質(zhì)粒簡(jiǎn)介

質(zhì)粒是一種獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的小分子雙鏈環(huán)狀DNA（數(shù)千堿基對(duì)），一般大小約106~108D，可自身復(fù)制和表達(dá)，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過適當(dāng)改選后便可成為良好的載體。作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒的定義1、質(zhì)粒DNA的構(gòu)型SC型共價(jià)閉合環(huán)形DNA（cccDNA）OC型開環(huán)DNA（ocDNA）L型線性DNA（cDNA）2、不同質(zhì)粒的分子量大小差異相當(dāng)顯著：106~108D

3、作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分：復(fù)制基因（replicator）、選擇性記號(hào)、克隆位點(diǎn)

質(zhì)粒的生物學(xué)特性4、質(zhì)粒DNA編碼著一些重要的非染色體控制的遺傳性狀。

抗性特征、代謝特征、修飾寄主生活方式的因子都等（見選擇標(biāo)記）按接合轉(zhuǎn)移功能分類主要基因按抗性記號(hào)分類非接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，生長(zhǎng)大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)

接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，細(xì)菌染色體區(qū)段F質(zhì)粒（F因子）自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Ent質(zhì)粒Tragenecanmakecellformpillisandcellularsurfacesubstancewhichmakeaconjugationbetweenhostandvector.Finallygeneticmaterialcanmovefromacelltoanother.5、質(zhì)粒的的接合轉(zhuǎn)移5、質(zhì)粒的的接合轉(zhuǎn)移5、質(zhì)粒的的接合轉(zhuǎn)移Someplasmidswithouttragenebothhavebomsite(oriTsite)andmobgene.Theseplasmidsmayownmobilization.Thereasonisthefollowing:Theproductofmobgenecanopennon-conjugativeplasmidoriTsitewhichleadstonon-conjugativeplasmidmovingbytrageneproduct.6、質(zhì)粒的遷移作用6、質(zhì)粒的遷移作用低拷貝的質(zhì)粒(1-3):嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒(接合型)

高拷貝的質(zhì)粒(10~60)：松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（非接合型）7.質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型在同一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，不能同時(shí)含有兩種不同的質(zhì)粒。也稱為質(zhì)粒的不相容性。是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。質(zhì)粒的不親合性分子基礎(chǔ)，主要是由于它們?cè)趶?fù)制功能之間的相互干擾造成的。8、質(zhì)粒的不親合性質(zhì)粒不相容性的分子機(jī)制質(zhì)粒不相容性現(xiàn)象圖解1、氯化銫密度梯度離心法；2、堿變性法；3、微量堿變性法。

質(zhì)粒DNA的分離與純化

質(zhì)粒DNA占總DNA的1%～2%；在細(xì)胞裂解及DNA分離過程中，大分子量的細(xì)菌染色體易斷裂成線性片斷，而質(zhì)粒DNA分子量小，結(jié)構(gòu)緊密仍保持完整的狀態(tài)；染色劑溴化乙錠（EB）能摻入到DNA鏈的堿基中，導(dǎo)致鏈的解旋；而且形成的EB-DNA復(fù)合物中，EB含量越高，密度會(huì)越低。1.氯化銫密度梯度離心法首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）來促進(jìn)大腸桿菌的細(xì)胞裂解。將溴化乙錠的氯化銫溶液加到清亮的大腸桿菌裂解液中，EB會(huì)嵌入到DNA鏈的堿基中去。在EB達(dá)到飽和時(shí)，進(jìn)行氯化銫密度梯度離心。流程

根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓?fù)鋵W(xué)上的差異而發(fā)展出來的。在pH值12.0～12.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性。通過冷卻或恢復(fù)中性pH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速?gòu)?fù)性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA2.堿變性法質(zhì)粒載體的構(gòu)建與類型質(zhì)粒載體的構(gòu)建質(zhì)粒載體的選擇性標(biāo)記質(zhì)粒載體的分類重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體其他重要的質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問題Ⅰ.質(zhì)粒載體的構(gòu)建

新陳代謝特性；對(duì)大腸桿菌素E1的免疫性；抗菌素抗性；四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性、鏈霉素抗性、卡那霉素抗性

大多數(shù)質(zhì)粒本身帶有抗菌素基因；抗菌素抗性記號(hào)便于操作、易于選擇。Ⅱ.質(zhì)粒載體的選擇記號(hào)Ⅲ.質(zhì)粒載體的分類高拷貝的質(zhì)粒載體克隆的目的是為分離大量的高純度的克隆基因低拷貝的質(zhì)粒載體有些克隆的編碼基因，其產(chǎn)物含量過高會(huì)嚴(yán)重的干擾寄主細(xì)胞的正常新陳代謝活動(dòng)。編碼表面結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一些基因、調(diào)節(jié)細(xì)胞基礎(chǔ)代謝活動(dòng)的蛋白質(zhì)編碼基因以及囊纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因等。Ⅲ.質(zhì)粒載體的分類失控的質(zhì)粒載體（runawayplasmidvectors）是一些低拷貝的質(zhì)粒，其復(fù)制控制是溫度敏感型的，也就是說在不同的溫度下，拷貝數(shù)會(huì)有顯著的變化。

pBEU1和pBEU2質(zhì)粒，在30度下，每個(gè)寄主細(xì)胞只含有適量的拷貝數(shù)，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過35度時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制將失去控制，每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)便持續(xù)上升。在這種高溫環(huán)境下，細(xì)胞的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的合成可按正常的速率持續(xù)2~3小時(shí)。最后得到超量的基因編碼產(chǎn)物，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制失去存活能力，積累的質(zhì)粒DNA占細(xì)胞總DNA的50%。Ⅲ.質(zhì)粒載體的分類插入失活型質(zhì)粒載體將外源DNA片斷插入在質(zhì)粒上會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)基因失活的位點(diǎn)，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度的提高獲得陽性克隆的機(jī)會(huì)。Example：在pBR329質(zhì)粒載體的EcoR1位點(diǎn)插入外源片斷，會(huì)使氯霉素抗性基因失活，在篩選的氯霉素敏感的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞群體中，含有插入片斷的重組體質(zhì)粒的幾率會(huì)顯著上升。

Ⅲ.質(zhì)粒載體的分類正選擇的質(zhì)粒載體正向選擇：應(yīng)用只有突變體或重組體才能正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇。這種質(zhì)粒載體具有直接選擇記號(hào)并可賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。Ⅲ.質(zhì)粒載體的分類Example：

質(zhì)粒pKN80有來自Mu噬菌體DNA的EcoR1-C的片斷，編碼一種致死功能的kil基因。該質(zhì)粒在Mu噬菌體的溶源菌株中正常復(fù)制；在非溶源菌株中是致死的。在HindIII或HpaI位點(diǎn)插入外源DNA片斷后，會(huì)產(chǎn)生具Ampr表型的Mu噬菌體的非溶源的轉(zhuǎn)化子菌株。正向選擇質(zhì)粒載體的條件限制：

1、需要特殊的寄主菌株或選擇培養(yǎng)基

2、可使用的克隆位點(diǎn)少

3、假陽性水平高

4、不能夠調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)活性表達(dá)型的質(zhì)粒載體表達(dá)載體：按特殊設(shè)計(jì)構(gòu)建的，能使克隆在其中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列，在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體。Ⅲ.質(zhì)粒載體的分類主要包括：大腸桿菌的啟動(dòng)子、及操縱位點(diǎn)序列、多克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯信號(hào)、質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)及抗菌素抗性基因。待表達(dá)的真核基因編碼序列被克隆在緊挨于啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)上，而且必須是其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸末端這一頭靠近啟動(dòng)子方向插入，才能在啟動(dòng)子控制下進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄。 1、pSC101質(zhì)粒載體；

2、ColE質(zhì)粒載體；

3、pBR322質(zhì)粒載體；

4、pUC質(zhì)粒載體；

5.其它的重要的質(zhì)粒載體Ⅳ.重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體（1）一種嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有1~2個(gè)拷貝；（2）分子量9.09kb，（3）編碼有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（tetr

）。（4）有Hind

、EcoR、BamH、Sal、Xho、Pvu、、Sma7種核酸內(nèi)切限制酶。其中在Hind

、BamH、Sma3個(gè)位點(diǎn)克隆外源DNA，都會(huì)導(dǎo)致tetr

基因失活。（5）是第一個(gè)真核生物的克隆載體。1.pSC101質(zhì)粒載體（1）松弛型復(fù)制控制的多拷貝的質(zhì)粒，（2）能產(chǎn)生細(xì)菌素。細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌的正常生命活動(dòng)有抑制作用（復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯能量代謝等）。但含有對(duì)細(xì)菌素的免疫基因。2.ColE1質(zhì)粒載體

用ColE1質(zhì)粒特征為基礎(chǔ)建立的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，存在一定的缺陷性：

1、應(yīng)用大腸桿菌素免疫作為標(biāo)記操作上不方便；

2、在細(xì)菌群體中，能夠以相當(dāng)高的頻率自發(fā)的產(chǎn)生出抗菌素的突變體細(xì)胞。3.pBR322質(zhì)粒載體“P”表示是一種質(zhì)粒；“BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個(gè)字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示實(shí)驗(yàn)編號(hào)。pBR322的構(gòu)建：為改進(jìn)轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，并具有相對(duì)小的分子量、高拷貝數(shù)、外源基因插入不影響質(zhì)粒的復(fù)制功能、多克隆位點(diǎn)（多種限制酶的單一切割位點(diǎn)）、質(zhì)粒的穩(wěn)定性（克服質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移能力）

pBR322的構(gòu)建過程pBR322的結(jié)構(gòu)來源pBR322的形體圖1、具有較小的分子量；

它的分子量為4363bp?？寺≥d體的分子量大小不要超過10kb。

2、具有較多的MSC和有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。

pBR322DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識(shí)別位點(diǎn)。其中7種內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識(shí)別位點(diǎn)在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，所以9個(gè)限制酶切位點(diǎn)插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr

基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識(shí)別位點(diǎn)。pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)a.在pBR322質(zhì)粒的BamH或SalI位點(diǎn)插入外源DNA片斷，切斷了tetr基因編碼序列的連續(xù)性，使之失去活性，產(chǎn)生出AmprTets表型的重組pBR322質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入AmpsTets的大腸桿菌細(xì)胞。先涂布在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，篩選出具Ampr菌落，再將它們涂布Example:于含四環(huán)素的選擇性培養(yǎng)基上。插入外源片斷的重組質(zhì)粒不能在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。b.在Pst或Sca識(shí)別位點(diǎn)插入外源片斷會(huì)導(dǎo)致Ampr基因的失活，產(chǎn)生AmpsTetr表型的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌之后，獲得的重組子可以比較快的檢測(cè)出來。其依據(jù)是Ampr表型的細(xì)胞可以合成β-內(nèi)酰胺酶，它能使青霉素轉(zhuǎn)變成青霉酮酸，而這種青霉酮酸能與碘結(jié)合。在含有可溶性淀粉和四環(huán)素的富裕培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子，經(jīng)37度培養(yǎng)過夜后，在此平板上加入少量的碘指示劑溶液產(chǎn)生青霉素β-內(nèi)酰胺酶Ampr的菌落，其周圍的碘指示劑溶液變得明亮，而Amps菌落無此反應(yīng)。c、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后每個(gè)細(xì)胞中可積累1000~3000個(gè)拷貝。當(dāng)加入蛋白質(zhì)合成抑制劑-氯霉素時(shí),細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂均受到抑制,緊密型質(zhì)粒復(fù)制停止,而松馳型質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制,質(zhì)?？截悢?shù)可由原來20多個(gè)擴(kuò)增至1000-3000個(gè),此時(shí)質(zhì)粒DNA占總DNA的含量可由原來的2%增加至40-50%。

人們應(yīng)用多克隆位點(diǎn)技術(shù)，在pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其5’-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ’基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。

4.pUC質(zhì)粒載體

一種典型的pUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個(gè)部分：

1、來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）；

2、氨芐青霉素抗性基因（ampr

）,但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不在含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的但識(shí)別位點(diǎn)。

3、大腸桿菌β-半乳糖基因（lacZ）的啟動(dòng)子及編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱之為lacZ’基因；

4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。典型的pUC系列的質(zhì)粒載體特征pUC質(zhì)粒載體的形體圖具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù);

僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點(diǎn)；在操作過程中復(fù)制起點(diǎn)內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變?cè)斐闪嘶騬op的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個(gè)細(xì)胞500~700個(gè)拷貝。適用于組織化學(xué)檢測(cè)重組體；

具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補(bǔ)作用，用Xgal顯色對(duì)重組子進(jìn)行鑒定，而pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段．

方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)藍(lán)白斑篩選的原理喪失遷移功能的質(zhì)粒載體能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體Ⅴ.其它的重要的質(zhì)粒載體擁有較高水平的拷貝數(shù),平均每個(gè)大腸桿菌寄主細(xì)胞可達(dá)30~45份;失去了bom位點(diǎn)，即便在共存的F質(zhì)粒提供轉(zhuǎn)移裝置的條件下，也不可能發(fā)生遷移作用。喪失遷移功能的質(zhì)粒載體pGEM-3Z是一種與pUC系列十分類似的小分子的質(zhì)粒載體，總長(zhǎng)度2743bp，編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)lacZ’基因。pGEM-3Z與pUC質(zhì)粒之間的主要區(qū)別是，它具有兩個(gè)來自噬菌體的啟動(dòng)子，即T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子，它們?yōu)镽NA聚合酶的附著作用提供了特異的識(shí)別位點(diǎn)。能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體

現(xiàn)在以發(fā)展出了一大批在多克隆位點(diǎn)區(qū)附近參入噬菌體RNA聚合酶啟動(dòng)子的簡(jiǎn)單的質(zhì)粒載體，它們都是由pUC系列載體派生而來的。

噬菌體的RNA聚合酶，所合成的RNA轉(zhuǎn)錄本除了可作為雜交探針之外，在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)譯體系或在麥胚無細(xì)胞轉(zhuǎn)移體系中進(jìn)行體外蛋白質(zhì)的合成。在反應(yīng)混合物中加入m7GpppG，能形成5’的帽子結(jié)構(gòu)，進(jìn)行有效的蛋白質(zhì)合成。

是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvector

）e.g.早期發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質(zhì)粒載體、大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體、大腸桿菌-牛乳頭瘤病毒。迄今還沒有發(fā)展出適用的大腸桿菌-植物細(xì)胞穿梭載體。1、質(zhì)粒載體不穩(wěn)定性的類型結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性：主要指由轉(zhuǎn)位和重組作用所引起的質(zhì)粒DNA的重排與缺失。分離的不穩(wěn)定性：在細(xì)胞分裂過程中，有一個(gè)子細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒DNA拷貝，并最終增值成為無質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。六、質(zhì)粒載體的穩(wěn)定性問題 DNA的缺失、插入和重排是造成質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的原因。質(zhì)粒的自發(fā)缺失：同向重復(fù)短序列之間的同源重組。寄主染色體及質(zhì)粒載體上的IS因子或轉(zhuǎn)位因子也會(huì)引起結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性

細(xì)胞分裂過程中發(fā)生的質(zhì)粒不平均的分配，也是導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定性的重要原因，將這種起因于質(zhì)粒的缺陷性分配所造成的質(zhì)粒的丟失現(xiàn)象，叫作質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性。分離的不穩(wěn)定性質(zhì)粒分離方式要使質(zhì)粒能夠穩(wěn)定的遺傳，必須保證平均每個(gè)世代質(zhì)粒最少?gòu)?fù)制一次；并且，細(xì)胞分裂過程中，質(zhì)粒復(fù)制的拷貝必須分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去。主動(dòng)分配：a.平均分配機(jī)理：使每個(gè)子細(xì)胞剛好獲得一半數(shù)目的質(zhì)?？截恇.配對(duì)位點(diǎn)分配機(jī)理：只有一半數(shù)目的質(zhì)粒呈主動(dòng)分配，其余是隨機(jī)分配的。隨機(jī)分配：細(xì)胞分裂過程中質(zhì)?？截悢?shù)在兩個(gè)子細(xì)胞之間是隨機(jī)分配的。新陳代謝負(fù)荷對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)質(zhì)粒載體會(huì)加重寄主細(xì)胞的代謝負(fù)荷；外源克隆基因的產(chǎn)物對(duì)寄主細(xì)胞的毒害作用?？截悢?shù)差度對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的影響差度：不同細(xì)胞個(gè)體之間的質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)的差異程度，可影響質(zhì)粒載體丟失的速率。差度越大穩(wěn)定性越差；差度越小穩(wěn)定性越高。2.影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素在野生型的大腸桿菌細(xì)胞中，質(zhì)粒重組的重要結(jié)果是形成質(zhì)粒寡聚體，它也是造成質(zhì)粒載體不穩(wěn)定的原因之一。決定大腸桿菌培養(yǎng)物中含質(zhì)粒寡聚體細(xì)胞的比例有兩種主要因素：

質(zhì)粒DNA分子之間的重組頻率；含質(zhì)粒寡聚體細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。重組質(zhì)粒二聚體一旦形成，便會(huì)以高出質(zhì)粒單體分子兩倍的速度進(jìn)行復(fù)制，從而導(dǎo)致質(zhì)粒寡聚體的克隆增殖，即所謂的二聚體災(zāi)難（dimercatastrophe）3、寄主重組體系對(duì)質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的效應(yīng)三、噬菌體載體濕菌體的一般特性λ濕菌體載體單鏈DNA噬菌體載體噬菌粒載體柯斯質(zhì)粒載體本節(jié)主要內(nèi)容可脫離寄主細(xì)胞生存，但不能進(jìn)行復(fù)制。除了對(duì)寄主的依賴性，還具備其它的功能：

1、保護(hù)自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞；

2、將其核苷酸分子注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞；

3、將被感染的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系，從而長(zhǎng)生出大量的子代噬菌體顆粒；

4、使感染的細(xì)菌細(xì)胞釋放出子代的噬菌體顆粒Ⅰ.噬菌體的一般生物特性1.噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類型：

結(jié)構(gòu)：無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、絲狀體型（M13phage）核酸類型：最常見的是雙鏈線性DNA、雙鏈環(huán)形DNA、單鏈環(huán)形DNA、單鏈線形DNA、

ssRNA。Ⅰ.噬菌體的一般生物特性

不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的。大分子量的噬菌體生命周期比較復(fù)雜；對(duì)寄主的依賴性較低。有些噬菌體的DNA堿基不是由標(biāo)準(zhǔn)的A/T/C/G組成的。

Example：

T4噬菌體DNA沒有C堿基，取代的是5-羥甲基胞嘧啶（HMC）;SP01噬菌體DNA中沒有T堿基，取代的是5-羥甲基尿嘧啶（HMU）。Ⅰ.噬菌體的一般生物特性

2.噬菌體的溶菌生命周期噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。烈性噬菌體溶菌生長(zhǎng)的基本過程：吸附吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接受器上注入噬菌體DNA穿過細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞轉(zhuǎn)變被感染的細(xì)胞成為制造噬菌體顆粒的場(chǎng)所合成大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì)組裝包裝了DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒釋放合成的子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來

Ⅰ.噬菌體的一般生物特性3.噬菌體的溶源生命周期溶源生長(zhǎng)周期：是指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體的DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一個(gè)組成部分。Ⅰ.噬菌體的一般生物特性

現(xiàn)知道只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期溫和噬菌體：既能進(jìn)入溶菌生命周期又能進(jìn)入溶源生命周期的phage。溶源性細(xì)菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細(xì)菌(帶有原噬菌體的細(xì)菌)溶源化：用溫和噬菌體感染細(xì)菌培養(yǎng)物使之形成溶源性細(xì)菌的過程整合：噬菌體的DNA是被包容在寄主細(xì)胞染色體DNA中原噬菌體：在溶源細(xì)菌內(nèi)存在的整合的或非整合的噬菌體超感染免疫性：溶源性細(xì)菌不能夠被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再感染。Ⅰ.噬菌體的一般生物特性溶源周期的主要特征：

λ噬菌體和P1噬菌體λ噬菌體的特征：噬菌體的DNA分子注入細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)過短暫的轉(zhuǎn)錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉(zhuǎn)錄活性便被一種阻遏物所關(guān)閉噬菌體的DNA分子插入到細(xì)菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)、增殖，噬菌體的基因作為細(xì)菌染色體的一部分進(jìn)行復(fù)制。Ⅰ.噬菌體的一般生物特性Ⅰ.噬菌體的一般生物特性溶源噬菌體的誘發(fā)：依賴于阻遏基因與操縱基因的相互作用。阻遏物被一種蛋白酶切割，失活，使噬菌體轉(zhuǎn)錄。需要?jiǎng)h除酶（excisionase）將噬菌體的DNA從大腸桿菌染色體上刪除下來，使之形成環(huán)形的DNA分子，恢復(fù)溶源周期開始時(shí)的狀態(tài)，進(jìn)入溶菌周期。Ⅰ.噬菌體的一般生物特性λ噬菌體載體

大腸桿菌噬菌體λ為長(zhǎng)尾噬菌體科，是一類中等大小的大腸桿菌病毒，其基因組為雙鏈線狀DNA，由48502對(duì)堿基組成，分子量3.2×107，約50個(gè)基因，特點(diǎn)是相關(guān)基因成簇排列，形成若干個(gè)操縱子?；蚪M兩端為粘性末端，中間有相當(dāng)長(zhǎng)的DNA片段是裂解生長(zhǎng)非必需的，這就為其作為外源基因的克隆載體提供了方便。λ噬菌體由頭和尾構(gòu)成，其基因組組裝在頭部蛋白質(zhì)外殼內(nèi)部，其序列已被全部測(cè)出。感染時(shí)吸附位點(diǎn)為細(xì)胞壁。屬溫和性感染；感染的DNA環(huán)化并整合于宿主基因組中。以θ環(huán)雙向復(fù)制，然后通過滾環(huán)機(jī)制單向復(fù)制。用于感染大腸桿菌的λ噬菌體改造成的載體應(yīng)用最為廣泛。AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS

頭部基因尾部基因功能不明區(qū)

溶源化重組早期控制阻遏DNA合成溶菌生長(zhǎng)非必須區(qū)段cI基因：溶源過程控制基因。λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)各基因以基因簇的形式存在，有序轉(zhuǎn)錄早期：確立溶菌反應(yīng)

中期：基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果導(dǎo)致DNA的復(fù)制與重組

晚期：基因轉(zhuǎn)錄結(jié)果導(dǎo)致DNA被包裝為成熟蛋白λ

噬菌體的復(fù)制與重組構(gòu)建λ噬菌體載體的基本原理1.插入式載體一種只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)的派生載體。2.替換型載體（取代型載體）具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的λDNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。cI基因編碼的阻遏蛋白可使感染phage的細(xì)菌進(jìn)入溶源化，cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶源化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位點(diǎn)，插入失活后利用X-gal法篩選（藍(lán)白斑篩選）。插入式載體λ噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)的構(gòu)建。

野生型噬菌體染色體的中段對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制是非必要的，外源DNA可以取代這一片段，例如Charon4A、λEMBL3/4、Charon40等載體，這些載體是用Lac5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的LacZ）替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時(shí)將Lac5作為選擇標(biāo)記，使用時(shí)用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進(jìn)行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli內(nèi)繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。換型噬菌體λ是使用最廣泛的載體。替換式載體λ替換型載體（取代型載體）外源DNA取代噬菌體染色體中對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制非必要的片段(~20kb)高感染效率(109

轉(zhuǎn)化株/ug載體DNA,比質(zhì)粒高100倍)e.g.EMBL3,

DASH應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化λ載體，除去可取代的DNA片段；將上述所得的

λDNA載體臂同外源DNA片段的連接；對(duì)重組體的λDNA分子進(jìn)行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體替換型載體克隆外源DNA的步驟λ取代載體組裝連接侵染體外包裝λ噬菌體DNA體外重組后，一般必須經(jīng)過體外包裝，然后以噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入E.coli細(xì)胞內(nèi)。這是因?yàn)橐愿腥?infection)方式導(dǎo)入細(xì)胞的頻率可達(dá)106~108/μgDNA，而以轉(zhuǎn)染(translation)的方式導(dǎo)入的頻率僅為103~105/μgDNA。 λ噬菌體的包裝限制為野生噬菌體DNA（約48.5kb）的75%~105%。轉(zhuǎn)染效率低的原因：在DNA的體外連接反應(yīng)中，載體分子同外源DNA片段之間的結(jié)合，完全是按一種隨機(jī)的方式進(jìn)行的。由此形成的各種重組體分子中有相當(dāng)?shù)谋壤菦]有活性的。這樣的分子不能轉(zhuǎn)染寄主細(xì)胞，因而致使轉(zhuǎn)染效率明顯下降。

由于λ噬菌體包裝時(shí)，當(dāng)DNA的長(zhǎng)度短于野生型的78%或超過105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，要求λ載體DNA和外源DNA長(zhǎng)度之和在39～53kb之間。插入式載體可攜帶的外源ＤＮＡ片段較替換式為小。包裝限制體內(nèi)包裝 Charonbacteriophage，是F.R.Blattner等人于1977年在λ噬菌體基礎(chǔ)上發(fā)展出來的一種特殊的噬菌體載體。既有插入型；又有替換型在基因工程實(shí)驗(yàn)中的用途十分廣泛承受外源DNA的能力：幾個(gè)kb到23kb凱倫噬菌體載體（左右臂連接）（三段自身連接）（插入片段）

凱倫噬菌體載體進(jìn)行基因克隆的程序分離線性得凱倫噬菌體載體DNA；限制酶消化載體，產(chǎn)生兩條噬菌體臂斷和一條中央?yún)^(qū)段；分離這三個(gè)片斷；分離得噬菌體得兩條臂段與外源DNA片斷混合退火，加入DNA連接酶連接；重組的DNA分子同包裝蛋白質(zhì)混合溫育，獲得具有感染性能的噬菌體顆粒；包裝產(chǎn)物涂布在敏感細(xì)菌平板上，檢測(cè)含外源DNA插入的重組噬菌體。Ⅲ、單鏈DNA噬菌體載體

(M13)M13、f1、fd(親緣關(guān)系相近的大腸桿菌絲狀噬菌體)優(yōu)越性：1.單鏈DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復(fù)制形式的DNA簡(jiǎn)稱RFDNA；2.不論是RFDNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌；3.單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的多寡制約的，不存在包裝限制問題；4.容易測(cè)定外源DNA片斷的插入取向；5.可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。

單鏈DNA噬菌體載體 M13是一種含單鍵（+）DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb。這類載體主要用來獲得大量的單鏈ＤＮＡ片段，這種單鏈ＤＮＡ片段在遺傳學(xué)研究中主要用來測(cè)定ＤＮＡ序列（sanger雙脫氧法）、基因的定點(diǎn)突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。M13噬菌體載體M13單鏈DNA的復(fù)制型（RF，replicativeform）是呈雙鏈環(huán)形，此時(shí)的DNA，不會(huì)插入細(xì)菌基因組，持續(xù)復(fù)制，當(dāng)積累到100-200個(gè)拷貝后，噬菌體DNA編碼的正鏈特異結(jié)合蛋白很快就阻止了負(fù)鏈的進(jìn)一步生成，但以負(fù)鏈為模板的正鏈合成并未受到影響。大量游離的正鏈DNA很快參入到外殼蛋白中形成了大量新的噬菌體顆粒。M13噬菌體的特點(diǎn)感染Ecoli后，在宿主細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成雙鏈的復(fù)制型ＤＮＡ（replicationformDNA,RFDNA）?？梢韵筚|(zhì)粒ＤＮＡ那樣在體外進(jìn)行純化和操作。成熟的噬菌體顆粒僅能感染E.coli的F+細(xì)胞，這是因?yàn)檫@種噬菌體的感染位點(diǎn)在性散毛上。但是無論是RFDNA或ssDNA都能轉(zhuǎn)染E.coli的F+或F-細(xì)胞。噬菌體顆粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制約的，這一點(diǎn)正好與λ噬菌體相反。所以M13噬菌體并不存在包裝限制的問題。M13噬菌體的特點(diǎn)M13單鏈DNA噬菌體的生命周期PhageM13replicationinthehostcell:+RNA

polDNApolIII±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.具有多克隆位點(diǎn)(MCS)，方便克隆。許多M13載體的多克隆位點(diǎn)與質(zhì)粒載體pUC序列的多克隆位點(diǎn)是相同的，在克隆位點(diǎn)選擇上更為方便。

可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13RFDNA分子上的雙鏈DNA片段，到了子代噬菌體便成了單鏈的形式。所以如果要同時(shí)分離ＤＮＡ分子中的雙鏈，則需要兩種獨(dú)立的克隆。根據(jù)M13的生物學(xué)特性知道，M13子代噬菌體中總是只含有（＋）鏈，所以M13載體克隆的外源DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有DNA分子中的哪條鏈，則完全取決于外源ＤＮＡ克隆時(shí)的取向。這樣一來，為分別分離外源ＤＮＡ分子的兩條鏈帶來一定的麻煩，解決這一問題的一個(gè)行之有效的方法就是定向克隆技術(shù)。M13載體1.在這類載體的基因組中有一條飾變的β-半乳糖苷酶基因片段（Hind

片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位點(diǎn)的序列；

2.M13載體系列是應(yīng)用基因工程技術(shù)成對(duì)地構(gòu)建的，可有效地克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。M13載體系列的優(yōu)點(diǎn)M13克隆載體分子結(jié)構(gòu)圖Ⅳ、噬菌粒載體由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列。它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。噬菌粒載體具有較小分子量的共價(jià)、閉合、環(huán)形的基因組DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于進(jìn)行分離與操作；編碼一個(gè)ampr基因作為選擇記號(hào)，因此只有攜帶pUC118或pUC119噬菌粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，才能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，便于轉(zhuǎn)化子的選擇；拷貝數(shù)含量高，每個(gè)寄主可高達(dá)500個(gè)，所以只要用少量的