多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群摘要：初步發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中將水樣接種與乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基的發(fā)酵管內(nèi)，37度下培養(yǎng)，24內(nèi)小管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基渾濁，顏色改變，說明水中存在大腸桿菌，為陽性如果，如果出現(xiàn)產(chǎn)生氣泡但不變色或者變色但不產(chǎn)氣的情況，應(yīng)該延長培養(yǎng)至48小時(shí)，若仍不的為陰性反應(yīng)。平板分離實(shí)驗(yàn)中把初實(shí)驗(yàn)產(chǎn)期產(chǎn)酸的試管的菌接到伊紅美蘭瓊脂平板上然后培養(yǎng)24小時(shí)。復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中將以上大腸桿菌陽性菌落，經(jīng)涂色染色為革蘭陰性無芽孢桿菌，通過次試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)原理：初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置一個杜氏小管。乳糖能其選著作用，因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸桿菌能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)氣產(chǎn)酸。為便于觀察細(xì)菌的產(chǎn)酸情況，培養(yǎng)基內(nèi)加有溴甲酚紫作為指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后培養(yǎng)基由原來的紫色變?yōu)辄S色。初步發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中將水樣接種與乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基的發(fā)酵管內(nèi)，37度下培養(yǎng)，24內(nèi)小管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基渾濁，顏色改變，說明水中存在大腸桿菌，為陽性如果，如果出現(xiàn)產(chǎn)生氣泡但不變色或者變色但不產(chǎn)氣的情況，應(yīng)該延長培養(yǎng)至48小時(shí)，若仍不產(chǎn)氣的為陰性結(jié)果。平板分離：伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基有伊紅和美蘭兩種染料，在此作為指示劑，大腸桿菌發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時(shí)，該兩種染料及結(jié)合，使培養(yǎng)基產(chǎn)生有金屬光澤的深紫色菌落。復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：以上大腸桿菌陰性菌落，經(jīng)涂片染色為革蘭氏陰性無芽孢的，通過此試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。原理與初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)相同，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的，最后確定為大腸桿菌陰性結(jié)果。材料與用具：培養(yǎng)基乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)有倒置杜氏小管）三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)有杜氏小管）伊紅美蘭瓊脂平板2．無菌水3.用具載玻片滅菌帶玻璃塞空瓶滅菌試管滅菌吸管方法：1水樣的采取從不同水體（自來水、河水）中采集樣品2自來水檢查初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在2個含有50ml三倍濃縮的乳糖蛋白胨發(fā)酵燒瓶中，各加入100ml水樣。在10支含有5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，各加入10ml水樣。混勻后，37度培養(yǎng)24小時(shí)，24小時(shí)候沒產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)至48小時(shí)。平板分離經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，將產(chǎn)氣產(chǎn)酸及48小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管，分別劃線接種于伊紅美蘭瓊脂平板上，再與37度下培養(yǎng)18到24小時(shí)，將符合一下特征的菌落的一小部分，進(jìn)行涂片，革蘭染色，鏡檢。1深紫黑色、有金屬光澤2紫黑色、不帶或帶金屬光澤3但紫黑色、中心顏色較深復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)進(jìn)涂片、染色、鏡檢，如果為革蘭陰性無芽孢桿菌，則挑去該菌落的另一部分，從新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌落1到3個，37度培養(yǎng)24小時(shí)，結(jié)果若產(chǎn)氣又產(chǎn)酸，即證明有大腸桿菌存在。證實(shí)有大腸桿菌存在后，再根據(jù)初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的陽性管數(shù)查表1及可得大腸桿菌群數(shù)。3河水的檢查將水稀釋成1：10與1：100.分別吸取1ml1：10、1：100的稀釋水樣和1ml原水樣，各入裝有10ml普通濃度乳糖蛋白胨發(fā)酵管中。另外取10ml和100ml原水樣，分別注入裝有5ml和50ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵液的試管中。以下步驟同上述自來水的平板分離和復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。將100ml、10ml、1ml、0.1ml水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表2結(jié)果：自來水檢查實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為10ml水量的陽性管數(shù)為10支，100ml水量的陽性管數(shù)為2支，經(jīng)查表可知每升自來水樣中大腸菌群數(shù)為>230.河水檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果為接種水樣總量111.1ml試管中100ml、10ml、1ml、0.1ml的發(fā)酵情況為陽性，而接種水量為11.11試管中10ml、1ml、0.1ml的發(fā)酵情況為陽性，而0.01的發(fā)酵情況為陰性，查表可知每升河水的大腸菌群數(shù)為23800.結(jié)果討論：1.水樣的采集不具有代表性，可能會給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來誤差。2.自來水檢測試管實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)酵燒瓶故用三角瓶代替，而加入杜氏小管后氣不能直立，如果結(jié)果產(chǎn)氣的話不能很好的判斷，因而會給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來誤差。3.在進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)可能會引入其他的革蘭氏陰性菌，使結(jié)果出現(xiàn)誤差。4.河水檢查試管中水樣稀釋不均勻，也會給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來誤差。參考文獻(xiàn)：全桂靜，雷曉燕，李輝，微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，北京，化學(xué)工業(yè)出版社，2010.圖15ml三倍濃縮乳糖蛋白圖2培養(yǎng)24小時(shí)后河水的產(chǎn)氣和圖3培養(yǎng)24小時(shí)后自來胨發(fā)酵管培養(yǎng)前顏色顏色變化情況水的產(chǎn)氣和顏色變化情況圖4圖5平板分離實(shí)驗(yàn)的伊紅美蘭培養(yǎng)基的長菌情況圖6復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中普通濃度圖724h培養(yǎng)后自來水的顏圖824h培養(yǎng)后河水的顏乳糖蛋白胨發(fā)酵管培養(yǎng)前顏色色變