糖尿病心肌病大鼠心臟功能和結(jié)構(gòu)變化的初步研究

1972年，通過(guò)對(duì)糖尿病患者的解剖分析，發(fā)現(xiàn)了心肌強(qiáng)化（dc）狹窄、管腔增大和內(nèi)質(zhì)彌漫性纖維。糖尿病心肌?。╟d）的概念已經(jīng)提出。臨床和實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí),DC發(fā)生于糖尿病早期,病變心臟首先出現(xiàn)單純性的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化或者伴隨左心室容積、室壁厚度及重量增加,舒張功能下降;隨病程發(fā)展,心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、壞死、肥大和纖維化加重,心臟收縮、舒張及射血功能出現(xiàn)明顯障礙,最終可能引發(fā)心肌缺血和心衰,成為糖尿病患者的重要致死原因之一。導(dǎo)致DC發(fā)生的病理機(jī)制復(fù)雜,一般認(rèn)為與高血糖狀態(tài)、胰島素抵抗、脂肪酸含量升高、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)積聚、氧化應(yīng)激損傷(ROS)、多聚ADP核糖聚合酶(PARP)和蛋白激酶C(PKC)過(guò)度激活、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、低氧誘發(fā)因子-1(HIF-1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)下降等有關(guān),除此之外腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)也參與到DC疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究擬用高糖高脂飼料負(fù)荷小劑量鏈脲佐菌素復(fù)制類似臨床DC病變的大鼠模型,觀察病變模型動(dòng)物心臟功能和結(jié)構(gòu)的變化,并通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析初步探討此種方法造成的心臟功能損傷與結(jié)構(gòu)重塑之間的相關(guān)性,以期為研究DC病變的病理機(jī)制和表現(xiàn)形式以及相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1飼料和檸檬酸三鈉高糖高脂飼料(20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇、1%膽鹽和66.5%基礎(chǔ)飼料),北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供[SCXK(京)2005-2007];鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),Sigma公司(美國(guó))提供;檸檬酸,檸檬酸三鈉,北京化工廠產(chǎn)品;羥脯氨酸試劑盒,南京建成生物工程研究所提供。1.2生物氣象機(jī)器Ohaus天平:TP200型,美國(guó)Ohaus;OneTouchUltra穩(wěn)豪系列血糖儀,試紙批號(hào)287695,LifeScanInc.;離心機(jī):HeraeusInstruments,KendroLaboratoryProducts,德國(guó);紫外分光光度計(jì):Agilent8453,AgilentTechologies,德國(guó);多道生物信號(hào)分析系統(tǒng):BiopacSystemMP150,BiopacSystem,Inc.美國(guó);Nikon生物顯微鏡(配有偏振光濾光片),日本;Image-ProPlus5.0專業(yè)圖像分析軟件,美國(guó)。1.3動(dòng)物分組及模型建立SPF級(jí)Wistar大鼠,雄性,45只,體質(zhì)量180~200g,來(lái)源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2007-0001】,按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。大鼠于室溫22~25℃,相對(duì)濕度65%,12h明暗交替環(huán)境中適應(yīng)一周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物按體重隨機(jī)分為3組,正常對(duì)照組(n=15)、高糖高脂膳食組(n=15)和糖尿病心肌病模型組(n=15)。正常對(duì)照組和高糖高脂膳食組大鼠分別喂飼普通飼料和高糖高脂飼料12周。糖尿病心肌病模型組大鼠喂飼高糖高脂飼料6周后,按30mg/kg劑量一次性腹腔注射(i.p.)STZ(pH=4.5,4℃配制,隨配隨用;另外2組動(dòng)物i.p.同體積檸檬酸鹽緩沖液),72h后尾靜脈取血測(cè)空腹血糖,大于7.77mmol/L者入選實(shí)驗(yàn)研究(12只,另外3只剔除),繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料6周至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。所有動(dòng)物均自由飲水,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)動(dòng)物死亡情況。1.5心趨勢(shì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)至13周,大鼠稱重,按35mg/kg劑量i.p.戊巴比妥鈉溶液麻醉,仰位固定。將BiopacSystemMP150生物采集器的心電圖和心排量針式電極按照要求插入大鼠四肢皮下,固定阻抗電極間的距離,固定聽(tīng)診器于大鼠心臟二尖瓣搏動(dòng)最強(qiáng)處,采集心電圖、容積阻抗圖和心音圖,測(cè)心率(HR),計(jì)算得到每搏輸出量(SV)和心排量(CO)。心排量測(cè)定完畢后,隔日禁食12h,大鼠稱重,同上麻醉固定,分離右頸總動(dòng)脈,將20G靜脈套管由頸總動(dòng)脈插管至左心室,連接生物信號(hào)記錄儀記錄左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)、左心室最大收縮/舒張速率(±dp/dtmax)。1.6全心重及左心室重量指數(shù)心功能測(cè)定完畢后,取大鼠心臟,生理鹽水清洗后,濾紙吸取殘留血液,剪去血管等,稱量全心重量,然后剪去心房和右心室,稱取左心室重量,計(jì)算全心重指數(shù)(全心重/體重,HW/BW)和左心室重量指數(shù)(左心室重量/體重,LVW/BW)。1.7常規(guī)he染色心臟稱重結(jié)束后,于左心室赤道面橫切,取適量心肌組織,加10倍量甲醛固定,石蠟包埋,切片,厚度4μm,常規(guī)HE染色。顯微鏡下觀察左心室形態(tài),用Image-ProPlus5.0專業(yè)圖像分析軟件測(cè)定左心室前壁和室間隔厚度。每組3~4只動(dòng)物,每只動(dòng)物觀察2張切片,取平均值。1.8羥脯氨酸含量測(cè)定取約0.1g左心室組織,按試劑盒要求測(cè)定樣品中羥脯氨酸含量,按照膠原中羥輔氨酸含量13.4%比例,膠原含量以羥輔氨酸×7.46計(jì)算,以μg/mg組織表示。1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS17.0中one-wayANOVA對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果用用表示,用Pearsoncorrelation對(duì)心功能和心臟結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,P<0.05認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1心臟功能改變與正常對(duì)照組相比,高糖脂膳食組LVEDP值升高(P<0.05),其余指標(biāo)均沒(méi)有明顯變化(P>0.05),心臟功能改變較溫和;糖尿病心肌病模型組大鼠HR、LVSP、+dp/dtmax、SV和CO指標(biāo)明顯降低(P<0.05),同時(shí)LVEDP和-dp/dtmax值升高(P<0.05),大鼠心臟收縮和舒張功能出現(xiàn)明顯障礙,心排量下降,結(jié)果見(jiàn)表1。2.2高糖高脂膳食組大鼠體重、全心重及左心室體重變化大鼠給予高糖高脂膳食并注射STZ后,體重、全心重量以及左心室重量明顯下降(P<0.01或P<0.001),但是全心重指數(shù)和左心室肥厚指數(shù)明顯增加(P<0.01),高糖高脂膳食組大鼠均未有明顯變化,見(jiàn)表2。2.3大鼠心肌病模型光鏡下觀察左心室縱切片HE染色結(jié)果顯示,正常對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞核清晰可見(jiàn),心肌細(xì)胞間有閏盤;高糖高脂組大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)輕微肥大,但未見(jiàn)明顯的病理變化;糖尿病心肌病模型組大鼠可見(jiàn)明顯的心肌纖維排列紊亂、斷裂,心肌細(xì)胞肥大,細(xì)胞核邊緣不清,融合,甚至消失。見(jiàn)圖1(封二)。與正常對(duì)照組比較,高糖高脂膳食組大鼠室間隔厚度明顯增加(P<0.01),但左心室壁厚度沒(méi)有明顯改變(P>0.05);糖尿病心肌病模型組大鼠室間隔和左心室壁厚度均明顯增加(P<0.001,P<0.05),結(jié)果見(jiàn)表3。2.4心臟沉積物的含量測(cè)定與正常對(duì)照組比較,糖尿病心肌病模型組大鼠心臟膠原含量明顯增加(P<0.05),高糖高脂膳食組沒(méi)有明顯改變。見(jiàn)圖2。2.5拉伸性能的測(cè)量采用Pearson相關(guān)分析,對(duì)各組動(dòng)物心功能和結(jié)構(gòu)指標(biāo)作相關(guān)性檢驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)表征收縮功能的指標(biāo)+dp/dtmax與HW/BW(r=-0.540,P<0.01)和LVW/BW(r=-0.532,P<0.01)都呈明顯的負(fù)相關(guān),表征舒張功能的指標(biāo)-dp/dtmax與HW/BW(r=0.545,P<0.01)和LVW/BW(r=0.443,P<0.05)呈明顯的正相關(guān),心排量(CO)與LVW/BW(r=-0.386,P<0.05)呈明顯的負(fù)相關(guān),結(jié)果見(jiàn)圖3。3高糖高脂飼料的降血糖作用及其機(jī)制實(shí)驗(yàn)室常用的DC動(dòng)物模型包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如db/db糖尿病小鼠、ob/ob肥胖小鼠、CIRKO小鼠、IRS-1KO小鼠、Zucker糖尿病肥胖大鼠等)、單純高脂飼料喂養(yǎng)或者單純化學(xué)試劑誘導(dǎo)(STZ、四氧嘧啶)等。本研究采用高糖高脂膳食喂養(yǎng)負(fù)荷STZ誘導(dǎo),高糖高脂膳食可以一方面誘導(dǎo)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),另一方面增加外源性的脂肪供給,并負(fù)荷小劑量STZ部分破壞胰島細(xì)胞功能,已被證明可以保持持續(xù)的高血糖狀態(tài)和造成糖脂代謝的紊亂,類似臨床2型糖尿病患者,并且有建立周期短、死亡率低等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí),高糖高脂膳食喂養(yǎng)負(fù)荷STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖值保持了穩(wěn)定的高水平狀態(tài),在心功能測(cè)定時(shí)間窗下,空腹血糖(FBG)值為(18.8±5.6)mmol/L,明顯高于正常對(duì)照組(3.6±0.3)mmol/L和單純高糖高脂膳食大鼠(4.0±0.2)mmol/L(P<0.001)。外周和心臟糖脂代謝紊亂是糖尿病心臟結(jié)構(gòu)和功能紊亂的重要誘因。高血糖可導(dǎo)致心臟I型和III型膠原沉積誘發(fā)心肌間質(zhì)纖維化;高血糖引發(fā)氧化應(yīng)激可提高AGEs含量和RAGE表達(dá),激活NF-κB,導(dǎo)致調(diào)控心臟α-重鏈肌球蛋白(α-myosinheavychain,α-MHC)轉(zhuǎn)化為β-MHC的基因表達(dá),改變心肌的收縮能力;同時(shí)AGEs積聚,還可改變結(jié)構(gòu)蛋白升高心肌硬度。而心臟能量利用轉(zhuǎn)換導(dǎo)致脂肪酸底物含量、轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化率增高,葡萄糖的利用率下降,心臟耗氧量和做功能力的下降,加重心肌病的損害。糖尿病心肌病變?cè)缙谛呐K功能障礙以舒張功能異常為主,表現(xiàn)為左心室舒張和被動(dòng)充盈受損,最終可發(fā)展為心衰(可不伴隨射血分?jǐn)?shù)的改變)。組織多普勒成像是檢測(cè)心衰不伴隨射血分?jǐn)?shù)變化患者左右心室長(zhǎng)軸局部收縮功能的常用手段,用于判斷射血分?jǐn)?shù)預(yù)后情況,有臨床研究顯示對(duì)于DC舒張功能紊亂的患者檢測(cè)結(jié)果僅顯示出輕度的收縮功能障礙,這可能與DC病變發(fā)展的階段有關(guān)。本研究血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果提示,大鼠高糖高脂膳食后心臟僅LVEDP值升高,其余指標(biāo)未見(jiàn)明顯變化,提示舒張功能出現(xiàn)一定障礙。負(fù)荷小劑量STZ后,除了有明顯的舒張功能異常(LVEDP、-dp/dtmax升高)外,還出現(xiàn)收縮功能異常(LVSP、+dp/dtmax值降低),并出現(xiàn)了心排量的明顯降低(SV、CO降低)。提示12周的單純高糖高脂膳食喂養(yǎng)可引起心臟溫和的功能異常,主要表現(xiàn)在舒張功能,負(fù)荷STZ破壞胰島細(xì)胞后引發(fā)的高血糖狀態(tài)以及觸發(fā)的一系列能量代謝紊亂才可能是廣泛的心臟功能紊亂主要誘因,但是深入機(jī)制還需進(jìn)一步探討。心臟結(jié)構(gòu)重塑是導(dǎo)致功能紊亂的重要原因。心肌內(nèi)膜下縱向纖維受心肌缺血、纖維化和肥厚影響大,糖尿病患者心室長(zhǎng)軸收縮能力下降會(huì)觸發(fā)心室徑向厚度和重量代償性增加以維持左心室射血分?jǐn)?shù),從而引發(fā)左心室肥厚,患者表現(xiàn)為左心室重量、左心室壁厚度、左心室重量指數(shù)明顯增加,從而導(dǎo)致舒張功能和收縮功能的障礙,射血分?jǐn)?shù)降低。本研究的結(jié)果顯示,高糖高脂飼料喂養(yǎng)后,僅顯示出室間隔厚度增加和輕度的心肌細(xì)胞肥大,其他心肌結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯變化。高糖高脂膳食負(fù)荷STZ后,心臟