大鼠右后路坐骨神經(jīng)切除的實(shí)驗(yàn)研究

坐骨神經(jīng)不僅用于下肢骨骼的代謝，還用于長(zhǎng)入骨骼的組織。這些神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)包含各種神經(jīng)纖維?，F(xiàn)在，在成骨細(xì)胞膜表面發(fā)現(xiàn)這些神經(jīng)纖維受體。神經(jīng)遞質(zhì)P物質(zhì)在直徑很小的初級(jí)傳入神經(jīng)中合成,并從末梢神經(jīng)終端釋放。目前研究證實(shí)神經(jīng)遞質(zhì)P物質(zhì)可以促進(jìn)與破骨細(xì)胞有關(guān)的骨吸收,但其作用機(jī)制仍不清楚。1材料和方法1.1動(dòng)物模型的生產(chǎn)1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料10月齡雄性Spragne-Dawley大鼠40只,體質(zhì)量200～300g,購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,飼養(yǎng)于通風(fēng)透光的環(huán)境下,攝食自來(lái)水和標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料。飼料由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心生產(chǎn)并提供。1.1.2小鼠坐骨神經(jīng)損傷模型隨機(jī)將大鼠分為2組,每組20只,分別為對(duì)照組(偽手術(shù)組)和實(shí)驗(yàn)組(坐骨神經(jīng)切斷組)。對(duì)照組行大鼠右后腿坐骨神經(jīng)偽手術(shù),實(shí)驗(yàn)組將大鼠右后腿坐骨神經(jīng)切除1.00cm,制造廢用性骨質(zhì)疏松模型。大鼠用10%水合氯醛以3mL/100g體質(zhì)量行腹腔麻醉后,沿右臀部及右后腿后側(cè)備皮后俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)。安爾碘消毒右大腿及臀部,觸到股骨大轉(zhuǎn)子及坐骨結(jié)節(jié)后,在兩體表標(biāo)志中間行長(zhǎng)約2cm縱行切口,在半腱肌、半膜肌和股二頭肌之間找到坐骨神經(jīng),在梨狀肌下緣處切除坐骨神經(jīng)1.00cm,然后縫合皮膚切口。對(duì)照組只分離顯露坐骨神經(jīng)后縫合切口。最后皮下注射青霉素10萬(wàn)U,連續(xù)用3d。1.1.3小鼠骨髓組織刮刮分別于術(shù)后6、12周將SD大鼠用水合氯醛3mL/100g體質(zhì)量劑量進(jìn)行腹腔麻醉,然后將大鼠處死。取右側(cè)股骨,用自制刮匙將骨髓組織小心刮出備用,冷凍保存;然后剔除軟組織。將股骨用5%戊二甲醛4%多聚甲醛混合固定液(多聚甲醛2mg,蒸餾水25mL,1mol/LNaOH1～3滴,25%戊二醛10mL,依次加入后,加0.2mol/L磷酸緩沖液至50mL)固定24h。1.2不同濃度酒精的精準(zhǔn)提取液、本工液、國(guó)白素-內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性檢測(cè)①大鼠術(shù)后6、12周分別取股骨,5%戊二甲醛4%多聚甲醛混合固定液固定24h。5%乙二胺四乙酸(EDTA)-Na2液(pH<7.2)脫鈣3個(gè)月,每3～4d換液1次,脫至可用針刺入骨組織為止。梯度酒精脫水24h,石蠟包埋。②石蠟切片,烤箱干烤2h脫蠟;梯度酒精脫水:二甲苯(20min)—二甲苯(20min)—100%酒精(10min)—95%酒精(10min)—85%酒精(5min)—70%酒精(5min)蒸餾水沖洗,磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡5min(如需采用抗原修復(fù),在此步驟后進(jìn)行)。3%H2O2去離子水,無(wú)色液體孵育5min,以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。滴加山羊血清工作液,室溫孵育10min。滴加1∶100比例稀釋的一抗,4℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗,5min×3次。滴加二抗,室溫孵育10min。PBS沖洗,5min×3次。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,室溫孵育10min。PBS沖洗,5min×3次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色。自來(lái)水充分沖洗。③蘇木素輕度重染—梯度酒精脫水—二甲苯透明—中性樹(shù)膠封片。采圖后用IDA-2000圖像自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。1.3統(tǒng)計(jì)處理采用t檢驗(yàn)。2組患者opg、rakenl在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)情況免疫組織化學(xué)檢測(cè)骨保護(hù)素(OPG)及核因子κB受體活化因子配體(RANKL)的表達(dá)結(jié)果:OPG及RANKL陽(yáng)性表達(dá)定位于胞質(zhì),呈棕黃色,表達(dá)部位在成骨細(xì)胞。術(shù)后6周,OPG在對(duì)照組中表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(0.185±0.006),而在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)呈弱陽(yáng)性(0.151±0.003),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后12周,OPG在對(duì)照組中表達(dá)呈陽(yáng)性(0.176±0.019),在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)也呈陽(yáng)性(0.164±0.010),2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后6周,RANKL在對(duì)照組中表達(dá)呈弱陽(yáng)性(0.162±0.004),而在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(0.215±0.020),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后12周,RANKL在對(duì)照組中表達(dá)呈陽(yáng)性(0.176±0.022),在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)也呈陽(yáng)性(0.197±0.008),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3骨微環(huán)境中raskl和opg的表達(dá)坐骨神經(jīng)切斷術(shù)是一種制作廢用性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的有效方法,神經(jīng)切斷術(shù)后肢體癱瘓可以導(dǎo)致廢用性骨代謝負(fù)向平衡。但在隨后的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):神經(jīng)切斷術(shù)后,對(duì)側(cè)肢體也出現(xiàn)了幾乎相同狀況的骨質(zhì)疏松。制動(dòng)并不是導(dǎo)致廢用性骨質(zhì)疏松的唯一途徑,可能還有其他因素參與其中?，F(xiàn)有研究表明:P物質(zhì)是一種神經(jīng)肽類(lèi)激素,是廣泛分布于全身的神經(jīng)遞質(zhì),主要分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng),呈現(xiàn)復(fù)雜的生理效應(yīng)。在人體多種骨組織內(nèi)分布有P物質(zhì)樣神經(jīng)纖維,包括長(zhǎng)骨、關(guān)節(jié)、牙齒等,以代謝活躍的部位如骨膜、干骺端及骺板附近分布最多,在骨干處的皮質(zhì)和骨髓則相對(duì)較少。這些肽能神經(jīng)主要與血管伴行,有少數(shù)游離神經(jīng)末梢伸出并止于骨膜襯里細(xì)胞層、骨髓細(xì)胞團(tuán)等,其作用的靶細(xì)胞為成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等。王樹(shù)森等切斷大鼠單側(cè)坐骨神經(jīng),并將斷端近側(cè)結(jié)扎,結(jié)果發(fā)現(xiàn)脊髓后角P物質(zhì)含量在2～6周時(shí)下降至最低,隨之回升,至16周恢復(fù)正常。RANK/RANKL是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的主要信號(hào)途徑,目前國(guó)外對(duì)此做了大量研究:RANK受體上游主要存在2個(gè)配體即RANKL和OPG,當(dāng)RANKL和RANK結(jié)合后,就可激活其下游的信號(hào)途徑促進(jìn)破骨細(xì)胞形成,起到正向調(diào)節(jié)作用;而OPG可與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANK,從而抑制破骨細(xì)胞的分化和功能,起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用?？傊?RANKL/RANK/OPG信號(hào)軸在調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和功能方面起到至關(guān)重要的作用。最近研究結(jié)果認(rèn)為:一旦RANKL和RANK相結(jié)合,胞質(zhì)中的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNFreceptorassociatedfactor6,TRAF6)就和RANK膜內(nèi)部分特定的結(jié)構(gòu)域相結(jié)合,TRAF6下游的5條信號(hào)途徑被激活,其中核因子(NF)-κB、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、P38和ERK4條途徑主要涉及骨的重吸收功能,Src途徑主要與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生存、骨架重排有關(guān)。RANK可能通過(guò)一條新的信號(hào)途徑調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化。如上所述,微環(huán)境中OPG/RANKL表達(dá)量的相對(duì)比值對(duì)骨質(zhì)疏松過(guò)程有重要的影響。免疫組織化學(xué)研究顯示,RANKL和OPG被共同表達(dá)在幾乎所有的組織中。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)顯示,大鼠術(shù)后6周,對(duì)照組術(shù)側(cè)OPG表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性,實(shí)驗(yàn)組呈弱陽(yáng)性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后12周,實(shí)驗(yàn)組呈陽(yáng)性,對(duì)照組也呈陽(yáng)性,2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。大鼠術(shù)后6周,RANKL在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性,在對(duì)照組呈陽(yáng)性表達(dá),2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后12周,RANKL在實(shí)驗(yàn)組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),對(duì)照組呈陽(yáng)性表達(dá),2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:坐骨神經(jīng)切斷術(shù)后大鼠股骨內(nèi)微環(huán)境中P物質(zhì)與OPG呈正相關(guān),與RANKL呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明P物質(zhì)含量的高低可以影響到破骨細(xì)胞分化。正是由于坐骨神經(jīng)切斷術(shù)后P物質(zhì)含量降低,導(dǎo)致OPG濃度下降而RANKL濃度增高。如前所述,骨微環(huán)境中OPG/RANKL表達(dá)量的相對(duì)比值對(duì)骨質(zhì)疏松過(guò)程有重要的影響。OPG可與RANK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL,從而阻斷RANKL與