第十一章重組DNA技術的應用第一節(jié)DNA與疾病診斷一、基因診斷的含義基因診斷（genediagnosis）是基于基因與疾病的相互關系，利用現(xiàn)代生物學和分子遺傳學的技術方法，直接從DNA水平上來探測基因的存在，分析基因的類型和缺陷及其表達功能是否正常，從而達到診斷疾病的一種方法。二、基因診斷的原理及特點

（一）基因診斷的原理（二）基因診斷的特點與傳統(tǒng)的診斷方法比較，基因診斷有以下幾個特點：（1）以探測基因為目標，屬于“病因診斷”，針對性強、特異性高；（2）由于檢測技術十分敏感，故診斷靈敏度相當高；（3）由于基因探針或引物可為任何來源，任何種類，所以適應性強，診斷范圍廣；（4）在感染性疾病的基因診斷中，不僅可檢出正在生長的病原體，也能檢出潛伏的病原體；既能確定既往感染，也能確定現(xiàn)行感染；既能診斷普通菌株或病毒，也能檢出變異株；同時，能對那些不容易體外培養(yǎng)（如產(chǎn)毒性大腸桿菌）和不能在實驗室安全培養(yǎng)（如立克次體）的病原體作出診斷，所以大大擴大了診斷范圍。三、基因診斷的方法以核酸分子雜交、聚合酶鏈反應（PCR）和序列分析為基礎,建立了多種多樣的檢測方法。1DNA診斷常用檢測致病基因結構異常的DNA診斷方法有下列幾種：⑴斑點雜交：DNA樣品的溶液被點在濾膜上，變性、中和、干燥固定等。標記的探針直接和濾膜上的核酸雜交，再用放射自顯影或其他方法檢測雜交結果。⑵等位基因特異的寡核苷酸探針（Allele-specificOligonucleotideProbe，ASOProbe）雜交：根據(jù)點突變位點上下游核苷酸序列，合成約15-20個左右的寡核苷酸片段，其中包含發(fā)生突變的堿基，經(jīng)放射性核素或地高辛標記后作為探針，在嚴格雜交條件下，只有該點突變的DNA樣本，才出現(xiàn)雜交點，即使只有一個堿基不配對，也不可能形成雜交點。

⑶單鏈構象多態(tài)性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）：是一種基于單鏈DNA構象差別的點突變檢測方法。⑷限制性內切酶圖譜（restrictionmap）：如果DNA突變后改變了某一核酸限制性內切酶的識別位點，使原來某一識別位點消失，或形成了新的識別位點，那么相應限制性內切酶片段的長度和數(shù)目會發(fā)生改變。

⑸限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）：遺傳連鎖分析生物個體間DNA的序列存在差異，據(jù)估計每100-200個核苷酸中便有1個發(fā)生突變，這種現(xiàn)象稱為DNA多態(tài)性。

（6）基因芯片法（microarray）：又稱為DNA微探針陣列。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探針，通過與被標記的若干靶核酸序列互補匹配，與芯片特定位點上的探針雜交，利用基因芯片雜交圖象，確定雜交探針的位置，便可根據(jù)堿基互補匹配的原理確定靶基因的序列。

（7）DNA序列分析對致病有關的DNA片段進行序列測定，是診斷基因異常（已知和未知）最直接和準確的方法。

2.RNA診斷RNA診斷是以mRNA為檢測對象，通過對待測基因的轉錄產(chǎn)物進行定性、定量分析，確定其剪接、加工的缺陷及外顯子的變異，以判斷基因轉錄效率的高低，以及轉錄物的大小及正常與否，從而對疾病做出診斷。

（1）RNA印跡（northernblotting）RNA印跡是檢測基因是否表達，表達產(chǎn)物mRNA的大小的可靠方法，根據(jù)雜交條帶的強度，可以判斷基因表達的效率。

（2）RT-PCR是一種檢測基因表達產(chǎn)物mRNA靈敏的方法，若與熒光定量PCR結合可對RT-PCR產(chǎn)物量進行準確測定。（3）mRNA差異顯示PCR技術（DDRT-PCR）：是在轉錄水平上研究基因表達差異的有效方法。該技術在分析基因表達差異、繪制遺傳圖譜、分離特異性表達基因和臨床診斷遺傳疾病等方面具有特殊的優(yōu)勢，因此一經(jīng)建立就被廣泛應用,并取得了可喜的成果。

四、基因診斷的應用（一）感染性疾病目前，商品化的診斷試劑盒，已經(jīng)在病毒、細菌、支原體、衣原體、立克次體及寄生蟲感染診斷中得到了廣泛應用?；蛟\斷還可檢出病毒變異或因機體免疫狀態(tài)異常等原因不能測出相應抗原和抗體的病毒感染。1病原體診斷

（1）病毒性感染多種病毒性感染都可采用基因診斷檢測相應的病原體，基因診斷則可直接檢測病毒本身，具有高度敏感，快速準確等獨特的優(yōu)越性。（2）細菌性感染可應用基因診斷檢測多種致病性的細菌，傳統(tǒng)的實驗室診斷依賴痰涂片鏡檢和結核桿菌的培養(yǎng)與鑒定，但陽性率不高，所需時間長。目前應用PCR技術建立診斷方法，敏感度可達到少至100個細菌的水平，通過拷貝存在的特異性重復序列引物，既使菌株發(fā)生變異，也能準確檢出。2治療過程中的檢測（1）療效監(jiān)測：以PCR和基因芯片為主的核酸分析技術能對核酸進行定量檢測和變異分析，是療效觀察最好的檢測手段。（2）藥物基因組學：每個人由于遺傳背景的不同，對藥物的利用、代謝及敏感性均有差異，采用基因芯片檢測病人的相關基因信息，對臨床用藥提供最佳依據(jù)?？傊?，基因診斷技術在醫(yī)學領域的應用已越來越被人們所認識，它在進行傳染病疫情監(jiān)測病原體診斷、治療藥物選擇和療效檢測等方面具有十分重要的作用，必將為傳染病的防控和診治做出重大貢獻。（二）遺傳疾病依據(jù)造成遺傳性疾病的原因又可以將其區(qū)分成：單一基因缺陷的遺傳疾病、染色體變異所引起的遺傳疾病及由多重基因共同影響所造成的遺傳疾病及線粒體基因的變異所引起的疾病。（三）惡性腫瘤

從根本上說，癌癥是細胞水平上的一種遺傳性紊亂，是一種基因性疾病。從正常細胞發(fā)展成癌細胞，一個基本的變化是細胞的生長失去控制。相對于感染性疾病及單基因遺傳病來說，腫瘤的基因診斷難度更大得多。但腫瘤的發(fā)生和發(fā)展從根本上離不開基因的變化，所以基因診斷在腫瘤疾病中也會有廣闊的前景。其重要表現(xiàn)有以下幾方面：（1）腫瘤的早期診斷及鑒別診斷；（2）腫瘤的分級、分期及預后的判斷；（3）微小病灶、轉移灶及血中殘留癌細胞的識別檢測；（4）腫瘤治療效果的評價。五、問題及展望隨著后基因組學的不斷深入和分子診斷技術的不斷更新，尤其是臨床醫(yī)學各學科與分子遺傳學、分子生物學和儀器分析學等其他學科不斷交叉和互相滲透，人們對生物大分子和疾病關系的理解也會越來越深入，分子診斷將在對疾病的診斷、預防和治療方面發(fā)揮日益重要的作用，極大地推動現(xiàn)代臨床診斷醫(yī)學的發(fā)展。一、 基因治療的概念及內容（一）基因治療的定義：是用正常基因取代病人細胞中的缺陷基因，以達到治療分子病的目的。根據(jù)病變基因所處的細胞類型，基因治療可分為兩種形式，一種是改變體細胞的基因表達，即體細胞基因治療（somaticgenetherapy）；另一種是改變生殖細胞的基因表達，即種系基因治療（germlinegenetherapy）。第二節(jié)疾病的基因治療（二）基因治療的基本內容基因治療包括基因診斷、基因分離、載體構建以及基因轉移四項基本內容。

基因分離是指利用DNA重組技術克隆、鑒定、擴增、純化用于治療的基因，并根據(jù)病變基因的定位，與特異性整合序列(即同源序列)和基因表達調控元件進行體外重組操作。載體構建指將上述治療用的基因安裝在合適的載體上?；蜣D移有兩種方式，一種是體外導入（exvivo）,即在體外將基因導入細胞內，再將這種基因修飾過的細胞回輸病人體內，使這種帶有外源基因的細胞在體內表達，從而達到治療或預防的目的。另一種是體內導入（invivo），即將外源基因直接導入體內有關的組織器官，使其進入相應的細胞并進行表達。二、基因治療的分子機制用于基因治療的基因根據(jù)其功能及作用可分為以下四類。（1）基因矯正（genecorrection）和基因置換（genereplacement），即將缺陷基因的異常序列進行矯正，對缺陷基因精確地原位修復，不涉及基因組的其他任何改變。（2）基因增強（geneaugmentation），不去除異?；?，而通過導入外源基因使其表達正常產(chǎn)物，從而補償缺陷基因等的功能；（3）基因失活（geneinactivation），有些基因異常過度表達，如癌基因或病毒基因可導致疾病，可用反義核酸技術、核酶或誘餌（decoy）轉錄因子來封閉或消除這些有害基因的表達。（4）自殺基因（suicidegene），有些酶在動物體內是不存在的。如果將它們轉入腫瘤細胞，再輔以原代謝物或藥物，就能殺滅癌細胞。因此這類酶稱為自殺酶，相應的基因則為自殺基因。

三、載體系統(tǒng)基因導入載體系統(tǒng)是基因治療的關鍵技術，可分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。四、基因治療的策略與方法1.基因治療的靶組織肌肉、心肌、血管、肝、腦、皮膚、呼吸道、黏膜、腫瘤等組織均可作為基因治療的靶組織。2.基因治療的策略分子生物學的飛速發(fā)展和人類基因組計劃的完成，使人們能夠正確了解人類基因組的結構和功能，認識疾病發(fā)生的分子機制，這將為開展疾病的基因治療奠定基礎?；蛑委煹幕静呗杂幸韵聨追N。（1）基因置換基因置換就是把正常的外源基因導入生物體靶細胞內，對致病基因進行原位重組置換，以恢復基因的原有正常功能，從而達到治療的目的。（2）基因矯正基因矯正是指原位修復致病基因的點突變，以恢復原有基因的功能，而不一定改變致病基因的結構。（3）基因修飾基因修飾就是將有功能的目的基因導入原發(fā)病灶的細胞或其他類型的相關細胞，目的基因的表達產(chǎn)物補償致病基因的功能，但致病基因本身未得到改變。（4）基因抑制基因抑制是指導入外源基因以抑制原有的基因，其目的在于阻斷有害基因的表達。（5）基因封閉利用反義RNA堿基互補原理，通過載體的介導性封閉或阻斷有害基因的表達，從而達到基因治療的目的。3.基因治療中基因轉移方法（1）基因轉移的物理方法基因轉移的物理方法包括：直接注射、電脈沖介導法和顯微注射微粒子轟擊法等。（2）基因轉移的化學方法基因轉移的化學方法包括DNA磷酸鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、染色體介導法、脂質體包埋、多聚季鐵鹽等化學試劑轉移方法。（3）基因轉移的生物學方法基因轉移的生物學方法主要是指病毒介導的基因轉移，包括RNA病毒和DNA病毒兩類，如逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、單純疤疹病毒、痘苗病毒等。五、疾病的基因治療（一）遺傳性單基因疾病的基因治療是基因治療的理想侯選對象，設計治療方案時應考慮下列幾點因素：⑴對造成該疾病有關的基因應有較詳細的了解，并能在實驗室克隆適合真核細胞表達的有關基因的cDNA序列，供轉導用；⑵經(jīng)有功能基因轉導的體細胞，只要產(chǎn)生較少量原來缺少的基因產(chǎn)物就能矯正疾病；⑶即使導入基因過度表達，對機體應無不良作用；⑷有些遺傳疾病是某些特殊細胞基因缺損造成的，但那有關的細胞不易取出供體外基因工程操作用；⑸現(xiàn)在采用的以正常有功能的同源基因來增補體內的缺乏基因，因此要求增補的基因在病人壽命期間能穩(wěn)定表達，或重復治療，所以應考慮構建能長期持續(xù)穩(wěn)定表達外源基因的載體，并考慮將外源基因轉導干細胞。（二）病毒性感染目前病毒性感染主要治療對象為人免疫缺陷病毒（HIV）感染的艾滋病，主要有二種治療策略：①增強機體的抗HIV免疫反應；②抑制HIV的復制。許多科學家尚在研究其他更有效的抑制HIV復制的方法。（三）惡性腫瘤惡性腫瘤屬復雜基因疾病(complexgeneticdiseases)，可能涉及多種基因的異常，發(fā)病過程是多步驟的，至今雖有不少有關的基因被鑒定，但腫瘤發(fā)病的分子機制尚未清楚，目前臨床惡性腫瘤的基因治療策略有十余種之多。主要的有：1.免疫基因治療(immunogenetheray)2.自殺基因系統(tǒng)3.抑癌基因(tumorsuppressivegene)4.裂解腫瘤病毒（oncolyticvirus）（四）心血管疾病目前心血管疾病中基因治療最多的臨床方案為外周血管疾病造成的下肢缺血，及心臟冠狀動脈阻塞造成的心肌缺血。通過轉移血管內皮細胞生長因子（VEGF）或成纖維細胞生長因子（FGF）或血小板衍生生長因子（PDGF）等基因于血管病疫部位，通過這些因子的表達，以促進新生血管的生成，從而建立側肢循環(huán)，改善血供。六、問題及展望基因療法作為一種新興的治療技術無疑是近30年來生命科學發(fā)展的一種結果。時代在發(fā)展，科技在進步，理論在創(chuàng)新，高科技研究成果的出現(xiàn)如同任何新生事物的誕生一樣，運用合理，將有無限的生機與活力；應用不當，也會給人類造成極大的隱患。隨著分子技術的飛速發(fā)展，期望基因治療會有一個美好的前景，實現(xiàn)真正的臨床突破，造福人類指日可待。

由病毒、衣原體、支原體、立克次體、細菌、真菌、螺旋體、原蟲、蠕蟲等引起的疾病稱為感染性疾病（infectiousdiseases）。感染性疾病中具傳染性并可導致不同程度流行則又稱傳染?。╟ommunicablediseases，contagiousdiseases）。第三節(jié)傳染病的防治一、新發(fā)和再發(fā)傳染病的特征

傳染病的致病因素是有生命的病原體，它在人體內發(fā)生、發(fā)展的過程與其他致病因素所造成的疾病有本質上的區(qū)別，主要表現(xiàn)在：①有病原體：每一個傳染病都是由特異性的病原體所引起的；②有傳染性：這是傳染病與其他感染性疾病的主要區(qū)別。③有流行病學特征：傳染病的流行過程在自然和社會因素的影響下，表現(xiàn)出各種特征。④有感染后免疫：動物、人體感染病原體后，無論是顯性或隱性感染，都能產(chǎn)生針對病原體及其產(chǎn)物(如毒素)的特異性免疫；⑤大多數(shù)傳染病都具有該種病特征性的綜合癥狀和一定的潛伏期和病程經(jīng)過。二、傳染病防治的新策略及研究內容1.研究流行性傳染病的快速診斷技術

基因型是遺傳特征，相當穩(wěn)定可靠，可以作為病原體鑒定和診斷的重要依據(jù)。通過從基因水平上進行檢測，可進行早期診斷，并可直接探知病原體在體內的消長過程及其與機體相互作用而致機體損害的細節(jié)，從而在疾病表現(xiàn)型出現(xiàn)之前或早期采取相應的防治措施。2.疫苗的研究

防治傳染病最有效、最經(jīng)濟的方法是對易感人群進行預防接種。利用DNA重組技術為基礎的各類工程疫苗有望成為防治傳染病的重要手段。3.預防和控制藥物的篩選科學家們正在積極制作基因藥物，希望能盡快篩選出對新病毒有預防和控制療效的藥物。4.分子流行病學規(guī)律研究從基因、基因組（蛋白、蛋白組，包括基因組和蛋白組的變異）、細胞和機體等不同層次，研究病毒與宿主的相互作用關系、致病機理、感染的分子過程等，揭示病毒源、病毒感染途徑、病毒性疾病的發(fā)生與流行規(guī)律等，為病源控制、診斷技術、疫苗研制、藥物篩選與研制、病毒性疾病流行預警等提供科學依據(jù)。5.遺傳進化關系研究追本溯源，查明病原來源，確定病原與人、與動物的關系，以有效控制疫病。三、基因工程疫苗所謂基因工程疫苗就是用基因工程方法或分子克隆技術，分離出病原的保護性抗原基因，將其轉入原核或真核系統(tǒng)使表達出該病原的保護性抗原，制成疫苗，或者將病原的毒力相關基因刪除掉，使成為不帶毒力相關基因的基因缺失苗。（一）基因工程亞單位疫苗上世紀70年代發(fā)現(xiàn)從病原分離得到的結構組成具有免疫原性，這種非傳染性的亞單位能激發(fā)免疫保護反應，而不具有由完整病原免疫可能帶來的副作用。（二）顆粒載體疫苗一些基因的表達產(chǎn)物可以裝配成多聚體顆粒，將病原中編碼保護性抗原決定簇的基因片段融合到這些載體基因中，能表達并裝配成雜合顆粒，而病原的決定簇可能暴露于顆粒表面，賦與多個決定簇和顆粒性等優(yōu)點，其免疫原性大大優(yōu)于單價可溶性多肽疫苗。（三）病毒活載體疫苗

其原理是將外源目的基因插入載體病毒基因組的某些部位，使之高效表達但不影響該疫苗株的生存與繁殖。（四）細菌活載體疫苗

細菌活載體疫苗，除具有病毒活載體的優(yōu)點外，它還具有培養(yǎng)方便、外源基因的容納量大、刺激細胞免疫力強等優(yōu)點，因此具有巨大的潛力。（五）基因缺失疫苗基因缺失疫苗是通過基因工程方法，將與強毒株的毒力有關基因刪除，既不影響其增殖或復制，又保持其免疫原性的活疫苗。其突出的優(yōu)點是疫苗株穩(wěn)定，不易返強，十分安全。由于其免疫機制與感染相似，免疫針對多種抗原決定簇。（六）DNA重組疫苗它是指將編碼某種蛋白質抗原的重組真核表達載體直接注射到動物體內，使外源基因在活體內表達，產(chǎn)生的抗原激活機體的免疫系統(tǒng)，從而誘導特異性的體液免疫和細胞免疫應答。四、基因工程抗體

基因工程抗體