鉀離子通道的結構與功能研究進展

離子通道是細胞特定的兩親性膜整合蛋白質。它通過殘基側鏈的選擇性和離子相互作用，起到了特殊的滲透性障礙功能。離子通道與多種生命活動密切相關,同時也是藥物設計的重要靶標之一。自從采用了細胞膜片鉗和單通道記錄技術,人工膜離子通道重建技術、基因重組技術、通道蛋白分離、純化等生化技術使許多通道蛋白的分子結構已經(jīng)逐步清楚,其cDNA已經(jīng)被克隆。目前認為,K+通道是離子通道中種類最多,存在最廣泛且最復雜的一大類離子通道。研究成果表明,K+通道有兩大家族,他們的結構和功能各異。1通道蛋白的結構縱觀K+通道的研究發(fā)展史,有不同的分類方法,其分類依據(jù)大致為:電導、電壓與電流特征,生物種系,通道分子結構,氨基酸序列,通道蛋白的同源性等。在哺乳動物中K+通道共分為兩大家族:電壓門控通道家族和內向整流通道家族,它們的結構特征和功能有著顯著的差異。1.1k+ca2+k+通道電壓門控K+通道(除鈣激活K+通道KCa以外),為六跨膜結構單孔道(sixtransmembraneone-pore),經(jīng)6次(S1-S2)穿膜,在S5與S6之間夾一個相當于鈉通道P段的H5段。每個通道擁有4個如此重復的成分。此種基本結構與Na+、Ca2+通道相同。通道的活化閘門也是由4個S4構成(見圖1)。所不同的是鉀離子通道每個亞單位含有1或2個功能區(qū)(1or2poredomains;單p區(qū)或雙p區(qū)),而Na+、Ca2+通道則具有4個。電壓門控K+通道又稱電壓依賴K+通道(Kv),是已知種類最多的離子通道家族。又可以分為三類:(1)延遲整流K+通道(delayedrectifier)(Kr):Hodgkin等在烏賊巨軸突發(fā)現(xiàn)的K+通道屬于此類。膜去極化時經(jīng)過延遲才激活,失活也緩慢。時間從數(shù)百毫秒至數(shù)十秒不等。(2)A型瞬時K+通道(KA)和毒蕈間敏感的M通道:A型瞬時K+通道(KA)最初由Conner和Stevens在海兔神經(jīng)元記錄到而命名。它的激活和失活都迅速,由于活化后約1ms滅活閘門就啟動,故又稱為快瞬時K+通道(fasttransientKchannel)。(3)鈣激活K+通道(KCa),它受到電壓和鈣離子的雙重門控。其結構略有不同(見圖2),有兩個功能獨特的區(qū)域,為二跨膜結構單孔道。由去極化激活,但還受到胞內鈣離子濃度的調控。KCa又分為三類:largeconductance(BKCa)、smallconductance(SKCa)和intermediateconductancechannels(IKCa)。每一類中又可分成不同的亞類,在人類淋巴細胞中主要是IKCa1,在Jurkatcell中主要是SKCa2,SKCa3主要存在于B淋巴細胞和小鼠胸腺細胞中。1.2kv和roret組成多跨膜結構單孔道,為四跨膜結構單孔道,kir.我國各級別內向整流K+通道(Kir)的分子結構直到1993年才被闡明,它由兩次穿膜螺旋和夾于其間的H段構成,為四跨膜結構單孔道(sixtransmembraneone-pore),即只相當于Kv分子的后半部,它沒有閘門和電壓感受器(H5)結構。細胞膜KATP的分子結構及電生理學特點屬Kir。近數(shù)年來在線粒體膜上發(fā)現(xiàn)一類新型KATP通道(mitoKATP),其分類能否歸屬于Kir,目前尚未定論。2k+通道seK+通道的基本分子結構包括氨基末端胞質域的T1四聚功能域,六個跨膜α-螺旋域(S1-S6)、電壓感應域(S1-S4)、在S5-S6之間的孔區(qū)域(1個P環(huán))和一個細胞質內羧基胞質域。K+通道由孔道形成亞基(α-亞基超家族)和輔助亞基β組成。輔助亞基β可調節(jié)α-亞基的表達、分布、通道開放-關閉的動力學及藥理學特性等。2.1k+通道結構KcsA(鏈霉菌屬的K+通道)每個亞單元由兩個橫跨細胞膜的α螺旋組成,兩個α螺旋之間由一個孔區(qū)域連接,孔區(qū)域由角塔(在外螺旋(M1)和短螺旋(P)之間)、孔螺旋和選擇性濾器組成,大約含有30個氨基酸。兩個α螺旋的內螺旋面向離子通道中心,短螺旋(P)和內螺旋(M2)構成通道內壁,而外螺旋面向脂膜。4個亞單元的內螺旋在膜內的互相靠近,形成倒圓錐形。內螺旋相對于細胞膜以25°角傾斜并略帶彎曲,使得亞單元像“花瓣”一樣朝向胞外并靠近細胞膜的外表面,完整的KcsA是由M1-P-M2亞基構成的同源四聚體。在“花瓣”部位上的亞單位含有K+通道的信號序列,形成離子選擇性濾過區(qū)。K+通道孔道形成亞基主要由4個糖蛋白(亞單位)構成,與shake相關的哺乳動物K+通道亞單位,它們分別是Kv1(Shaker)、Kv2(Shab)、Kv3(Shaw)和Kv4(Shal)。但通道亞單位四者只居其一,其中每個亞單位蛋白迂回跨膜6次,分別命名為S1～S6區(qū),每個通道擁有4個如此重復成分。四個重復成分的功能區(qū)連結溝通,S5和S6之問的短膚參與構成孔道,成為離子通路的干道,此結構稱為“H5”區(qū)或通路區(qū)(見圖1)。N端和C端均位于細胞內,S4含有帶正電荷的氨基酸殘基,為電壓感受器,S4-S5鏈接區(qū)與鉀通道的電導大小和失活相關,人類K+通道S6螺旋含有一個保守的P-V-P基序,該基序起到鉸鏈作用,類似于KcsA中的T-V-G-Y-G基序。K+通道分子的N端與K+通道的快速“失活”有關,N斷形成一個球型失活粒子,阻斷通道內口,這種快速失活稱為N型失活。在N端失活粒子與膜相連的“鏈”插入50個氨基酸殘基段,可延緩K+通道失活過程。推測這是因為“鏈”加長后,失活粒子找不到進入K+通道內口所致。N端失活粒子突變后,K+通道不再失活。去除N端的shaker型K+通道失活緩慢的機理就非常明確,它依賴于S6細胞外端的氨基酸,稱為緩慢型或C型失活。N端還有一個T1結構域,C端也發(fā)現(xiàn)了一些功能序列。胞外區(qū)有三個N-連接糖基化位點、胞漿區(qū)含兩個cATP磷酸化位點。哺乳類動物K+通道H5區(qū)(通路區(qū))主要有三種結構(見圖2)。其一為電壓-門控型。特點為亞單位跨膜的S5與S6段間為兩者的功能區(qū),系單P區(qū)。其二為內向整流型K+通道(Kir),其結構類似于電壓門控與Ca++激活型,不同之處在于單P功能區(qū)位于S1與S2間。第三類結構特點為亞單位的6個跨段具有2個功能區(qū),分別位于S1與S2、S3與S4間,因而謂之雙P區(qū)型K+通道。兩功能區(qū)內經(jīng)S2與S3呈串連相通,故又稱為串連P區(qū)型K+通道。2.2kv1.2離子通道目前對K+通道孔道可溶性輔助亞基β的結構和功能還不是很多,一般認為與該亞基可能參與K+通道的開啟和失活。MacKinnon等最近發(fā)表了關于Shake家族的哺乳動物Kv的結構。Kv離子通道根據(jù)膜電壓來調控K+的穿膜過程。這些最新文章則研究了大鼠腦中Kv1.2離子通道及其β2亞基的晶體結構(β亞基可以在體內調控哺乳動物Kv離子通道的活性),分辨率可達2.9-Å。這個四倍性復合物具體的結構如下(見圖3):穿膜區(qū)域,包括通道的孔和四個電壓感應器(voltagesensor);一個膜內(T1)結構域,由四個Kv1.2亞基的N末端構成;四個β2亞基,結合到T1結構域上。這個離子通道有些類似于原核生物K+通道,但有一個重要區(qū)別就是:Kv1.2離子通道內螺旋的曲率(curvature)是由保守的Pro-X-Pro序列引起的,而原核生物鉀離子通道的曲率則是由一個Gly殘基引起的。最近有研究首次觀測到了KCHIP輔助亞基在分子和原子水平調節(jié)Kv4鉀通道功能的結構基礎,到了Kv4.3N-terminus與KChIP1的復合晶體結構(分辨率為3.2-Å),并從中發(fā)現(xiàn)這一復合物獨特的一種鉗狀活性位點(clampingaction),在這個位點中一個單KChIP1分子可以夾緊相鄰的兩個Kv4N-末端,形成一個八核苷酸序列(octamer)。而且Kv4.3N端最外側多肽被KChIP1表面的一延伸溝綁定,而這一溝槽是KChIP1調控Kv4.3不可或缺的結構,同時KChIP1分子也結合在臨近的T1位點,穩(wěn)定Kv4.3四聚體通道。3sh結論與k+通道的關系編碼K+通道的第一個基因是完全通過分子遺傳技術確定的。果蠅突變體暴露于酯類麻醉劑,腿、翅膀及腹部出現(xiàn)不自主的顫抖,這一突變體為shaker突變體。突變體神經(jīng)細胞不出現(xiàn)復極化,因而動作電位時間IK(A)shaker基因編碼了KA通道。shaker基因的定位很困難,最后是在應用了一種“染色體步移”(chromosomewalking)和作圖技術,才在突變體中發(fā)現(xiàn)shaker基因,1987年shaker基因DNA序列被測出。實際上shaker基因是個含有幾個內含子(instron)的巨大基因,編碼12個密切相關的K+通道,其初級轉錄是剪切后mRNA片段,選擇與不同的外顯子(exon)組合形成成熟的mRNA。隨后,用與shaker基因互補的寡聚核苷酸探針尋找相關基因,結果在果蠅又發(fā)現(xiàn)了另外三個基因,shal、shaw和shab。在哺乳動物亦發(fā)現(xiàn)了這四個基因,與果蠅的序列同源性在55%～82%之間。脊椎動物shaker基因是12個無內含子的基因家族。所以,雖然果蠅shaker通道的多樣性是由剪切后mRNA片段產(chǎn)生,但脊椎動物shaker通道是由各自的基因編碼而成。這表明K+通道多樣性在早期進化時存在兩種途徑。DNA序列分析顯示,果蠅及脊椎動物shaker、shal、shaw及shab基因編碼的K+通道的一個獨立的結構域。每一基因編碼產(chǎn)物含有6個跨膜(TM)疏水段,部分為A螺旋,N末端、C末端位于胞漿面。第5號基因slo,編碼BKCa通道,序列分析表明BKCa除K+通道常見的結構域外,有個很長的C末端,也可能含有更多的TM節(jié)段。內向整流K+通道Kir(已發(fā)現(xiàn)有12個相應基因:KCNJ1～KCNJ11和KCNK)為超極化電流所激活,去極化時滅活。4對k+通道的研究是進一步提高認識水平和完善的一個重要研究概念分子生物學和基因重組技術也為離子通道的研究提供有效的途徑,X衍射晶體學為K+通道的結構研究提供了直