高效液相色譜法測(cè)定藤茶的二氫楊梅素

藤茶是青桃科蛇葡萄糖植物的結(jié)實(shí)莖和葉，主要分布在廣西、湖南、福建等地。藤茶色綠起白霜,具有清熱解毒、抗菌消炎、祛風(fēng)除濕、強(qiáng)筋健骨的功效,常用于心腦血管疾病、高血壓等病證的防治。藤茶中含有大量的黃酮類化合物,并以二氫楊梅素(DMY)為主。二氫楊梅素具有抗衰老、抗高血壓、保肝護(hù)肝等功能。目前,測(cè)定藤茶中二氫楊梅素含量的方法很多,產(chǎn)地主要來(lái)自貴州、湖南、廣西,我們用HPLC法對(duì)廣西桂林產(chǎn)藤茶中的二氫楊梅素的含量進(jìn)行了測(cè)定。1儀器和試劑盒1.1準(zhǔn)對(duì)照品的測(cè)定藤茶(廣西桂林干燥藥材);二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院);甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、甲酸、三氯化鐵為分析純;甲醇、磷酸為色譜純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備和設(shè)備戴安Ultimate3000高效液相色譜分析儀(美國(guó)Dionex公司);鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ZF-2型三用紫外儀分析儀(上海市安亭電子儀器廠);預(yù)制薄層板(青島海洋化工廠分廠)。2方法和結(jié)果2.1供試品溶液的制備取藤茶20mg,料液比1∶35,加入甲醇超聲提取30min,3次,過(guò)濾濃縮,加入甲醇定容至10mL,0.45μm濾膜過(guò)濾,得供試品溶液。2.2對(duì)照溶液的制備2.3苯甲酰胺酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備吸取供試品溶液、二氫楊梅素對(duì)照品溶液10μL分別點(diǎn)于同一硅膠G板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶5)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以3%FeCl3乙醇溶液,在檢測(cè)波長(zhǎng)254nm處檢視,供試品色譜在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。2.4條件12.5方法研究2.5.1系統(tǒng)適用性測(cè)試按2.1項(xiàng)制備供試品溶液,按2.4項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積,二氫楊梅素對(duì)照品溶液和藤茶供試品溶液的色譜圖,見圖1、圖2。2.5.2對(duì)照品溶液的制備精密吸取二氫楊梅素對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1mL至1mL瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,得不同濃度的對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液,按2.4項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸,得線性回歸方程:Y=40.333X-0.0901r=0.9998結(jié)果表明二氫楊梅素在1.31~6.55μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.5.3精密度測(cè)試2.5.4進(jìn)樣測(cè)定精密吸取2.2項(xiàng)的對(duì)照品溶液,避強(qiáng)光放置,按2.4項(xiàng)色譜條件,每隔2h進(jìn)樣測(cè)定1次,每次進(jìn)樣5μL,測(cè)定二氫楊梅素的峰面積,結(jié)果表明在24h內(nèi)測(cè)得的峰面積無(wú)明顯變化,RSD為2.50%。2.5.5重復(fù)試驗(yàn)精密稱取藤茶6份,按2.1項(xiàng)制備供試品溶液,按2.4項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積,結(jié)果顯示重復(fù)性較好,RSD為1.90%。2.5.6加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知二氫楊梅素含量的藤茶20mg9份,分別加入1.31mg/mL二氫楊梅素對(duì)照品1.80、2.25、2.70mL,按2.1項(xiàng)、2.4項(xiàng)色譜條件測(cè)定,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表1。2.6藤茶中二氫楊樹氧基的含量精密稱取20mg藤茶樣品6份,按2.1項(xiàng)方法制備供試品溶液,按2.4項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果藤茶中二氫楊梅素的含量為29.55%。3討論3.1氫楊樹葉片的檢測(cè)經(jīng)DAD全波長(zhǎng)掃描后,二氫楊梅素對(duì)照品在290nm處有最大吸收,故確定290nm作為二氫楊梅素的檢測(cè)波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)考察甲醇∶0.05%磷酸流動(dòng)相的比例(25∶75、35∶65、40∶60、55∶45、90∶10),結(jié)果顯示,甲醇∶0.05%磷酸流動(dòng)相的比例為35∶65時(shí),出峰時(shí)間短,且無(wú)雜質(zhì)干擾。3.2氫楊樹巖樣的制備實(shí)驗(yàn)中分別考察了提取溶劑、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)樣品提取率的影響,提取溶劑體積分?jǐn)?shù)太低時(shí),所提取的水溶性雜質(zhì)較多;料液比增加時(shí),二氫楊梅素提取量也在不斷增加。當(dāng)達(dá)到飽和時(shí),既使繼續(xù)提高料液比,所提取的二氫楊梅素不會(huì)繼續(xù)增加反而下降。綜合考慮節(jié)能環(huán)保等因素,最終確定供試品溶液的制備方法為:藤茶20mg,以料液比1∶35加入甲醇超聲30min,重復(fù)提取3次。精密稱取二氫楊梅素對(duì)照品0.0131g,置10mL瓶中,加甲醇定容,制成含二氫楊梅素1.31mg/mL的對(duì)照品溶液。色譜柱:迪馬C18柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-0.05%磷酸溶液(35∶65);流速:0.8mL/min;柱溫: