分子體外診斷檢驗冷凍組織檢驗前過程的規(guī)范第3部分：分離DNAII目 次前 言 II引 言 III范圍 4規(guī)范性引用文件 4術(shù)語和定義 4總則 8實驗室外部 8實驗室內(nèi)部 10PAGEPAGE103DNA范圍DNA本文件適用于醫(yī)學(xué)實驗室和分子病理實驗室對冷凍組織中提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行的分子體外診斷檢驗，本文件不包括冷凍前經(jīng)過化學(xué)穩(wěn)定預(yù)處理的組織。注：國際、國家或地區(qū)法規(guī)或要求同樣能適用于本文件所涵蓋的特定內(nèi)容。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T22576.1-2018醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力的要求第1部分：通用要求（ISO15189:2012，IDT）術(shù)語和定義ISO15189界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。ISO和IEC維護(hù)的用于標(biāo)準(zhǔn)化的術(shù)語數(shù)據(jù)庫，地址如下：—— ISO/obp上獲得?！狪EC電子百科：可在/上獲得。3.1等分樣品aliquot假定取樣誤差忽略不計時，大量均質(zhì)物質(zhì)的一部分。注1：該術(shù)語通常適用于液體。組織是異質(zhì)的，所以不能等分。注2：該定義源于第[22],[23],[24]條參考文獻(xiàn)。3.2環(huán)境溫度ambienttemperature未經(jīng)調(diào)節(jié)的周圍空氣的溫度。3.3分析物analyte被測量名稱所代表的組分。[來源：GB/T21415-2008,3.2，有修改]3.4分析檢測性能analyticaltestperformance測量待測分析物的檢驗的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度。注：也能適用于其他試驗性能特性，比如穩(wěn)健性、重復(fù)性等。3.5生物樣本庫biobanking3.6冷缺血coldischemia組織自人體取出后至穩(wěn)定或固定前的存在狀況。3.7診斷diagnosis從其體征和/或癥狀中識別健康或疾病狀態(tài)，診斷過程能通過各種檢驗對個體狀況進(jìn)行分類，分成不同的類別或亞類，以便做出關(guān)于治療和預(yù)后的醫(yī)學(xué)決策。3.8DNA脫氧核糖核酸deoxyribonucleicacid以雙鏈或單鏈形式存在的脫氧核糖核苷酸聚合體。[SOURCE:ISO22174:2005,3.1.2][來源：SN/T2102.1-2008,3.1.2]3.9DNAase脫氧核糖核酸酶deoxyribonuclease催化DNA降解成更小組分的酶。3.10檢驗examination分析檢測analyticaltest以確定一個特性的值或特征為目標(biāo)的一組操作。注：從分離的分析物開始、包括各種用于定性或定量檢驗的參數(shù)測試或化學(xué)操作的過程。[來源：GB/T22576.1-2018，3.7，有修改,刪除原注1~3，補(bǔ)充新注，“分析檢測”被添加為首選術(shù)語。]3.11大體檢查grossing,grossexamination為獲得診斷信息，在準(zhǔn)備后續(xù)顯微鏡檢查過程中對病理標(biāo)本所做的肉眼檢查。3.12均質(zhì)homogeneous結(jié)構(gòu)和組成均勻3.13干擾物質(zhì)interferingsubstances（。3.14檢驗前過程pre-examinationprocess分析前階段preanalyticalphase分析前工作流程preanalyticalworkflow.10.18）的采集、運(yùn)送到醫(yī)學(xué)或病理實驗室和在實驗室內(nèi)進(jìn)行運(yùn)送、分析物（3.3）的分離并以分析檢驗（3.10）開始為結(jié)束的過程。注：檢驗前階段包括影響預(yù)期檢驗（3.10）結(jié)果的準(zhǔn)備流程。[來源：GB/T22576.1-2018，3.15，有修改]3.15能力驗證proficiencytest利用實驗室間比對，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評價參加者的能力。[來源：GB/T27043-2012,3.7，有修改]3.16室溫roomtemperature本文件中是指18℃-25℃。[SOURCE:ISO20184-1:2018,3.19]注：地方或國家法規(guī)可能存在不同定義。3.17樣品sample取自原始樣品（3.19）的一部分或多部分。[來源：GB/T22576.1-2018，3.24，有修改]3.18原始樣品primarysample標(biāo)本specimen為檢驗（3.10）、研究或分析一種或多種量或特性而取出的認(rèn)為可代表全部的一獨(dú)立部分的體液、呼出氣、頭發(fā)或組織。[來源：GB/T22576.1-2018，3.16，有修改]3.19穩(wěn)定性stability在特定條件下貯存時，樣品（3.17）材料在特定時間內(nèi)保持規(guī)定特性值在特定范圍內(nèi)的能力。注：本文件涉及的分析物（3.3）是所分離的DNA（3.7）。[來源：GB/T15000.2-2019，2.1.15，有修改]3.20貯存storage在適宜的條件下長時間中斷樣品、分析物或其衍生物（如染色切片或組織塊）的分析前工作流程，以保持其特性。注：通常在實驗室檔案庫或生物樣本庫中進(jìn)行長時間貯存。3.21確認(rèn)validation通過提供客觀證據(jù)對特定的預(yù)期用途或應(yīng)用要求已得到滿足的認(rèn)定。注：“已確認(rèn)”一詞用于表明相應(yīng)的狀態(tài)。[來源：GB/T19000-2016，3.8.13，有修改，刪除原注1和注3。]3.22驗證verification通過提供客觀證據(jù)對規(guī)定要求已得到滿足的認(rèn)定。注1：“已驗證”一詞用于表明相應(yīng)的狀態(tài)。注2：認(rèn)定能包括以下活動進(jìn)行替代計算；將新的設(shè)計規(guī)范與類似的經(jīng)驗證的設(shè)計規(guī)范進(jìn)行比較；進(jìn)行檢測和演示；在發(fā)布前審查文件。[來源：GB/T19000-2016，3.8.12，有修改]3.23熱缺血warmischemin失去正常血液供應(yīng)的組織從身體內(nèi)移除前的狀態(tài)。[SOURCE:ISO20184-1:2018,3.25]3.24工作流程workflow完成任務(wù)所需的一系列活動。[SOURCE:ISO20184-1:2018,3.26]總則醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量管理體系的通用要求，特別是關(guān)于標(biāo)本采集，接收和處理（包括避免交叉污染），參見GB/T22576.1-2018條款4.2,5.4.4,5.4.6或GB/T27020-2016條款8和7.2。有關(guān)實驗室設(shè)備、試劑和消耗品的要求應(yīng)遵循GB/T22576.1-2018條款5.3GB/T22576.1-2018條款或GB/T27020-2016條款6.2。（即整個工作流程（運(yùn)到醫(yī)學(xué)實驗室和在醫(yī)學(xué)實驗室內(nèi)與RNADNA10DNA在DNAISO14974關(guān)于標(biāo)本運(yùn)送和處理的安全說明應(yīng)符合GB/T22576.1-2018條款5.2.3和GB19781在整個檢驗前過程中，應(yīng)采取預(yù)防措施，避免不同標(biāo)本/樣品之間的交叉污染，例如，在可行的情況下使用一次性材料，或在處理不同標(biāo)本/樣品之間進(jìn)行適當(dāng)?shù)那鍧嵆绦?。（有關(guān)標(biāo)本采集、運(yùn)送、接收和處理的一般考慮，請參見ISO20658和ISO20387。實驗室外部標(biāo)本采集總則（參見條款。另參見GB/T22576.1-2018,5.4.4?；颊?標(biāo)本供者的信息記錄應(yīng)包括患者/標(biāo)本供者ID，能用編碼形式。該文件應(yīng)由負(fù)責(zé)標(biāo)本采集的部門記錄，并宜包括但不局限于：患者/標(biāo)本供者的相關(guān)健康狀況，例如：健康與否、疾病類型、伴隨疾病、人口學(xué)信息（如年齡、性別等）；組織采集前的常規(guī)醫(yī)學(xué)治療和特殊治療相關(guān)信息，例如麻醉劑、藥物、外科手術(shù)或診斷程序；患者/標(biāo)本供者的相應(yīng)的知情同意。標(biāo)本相關(guān)信息文件記錄應(yīng)包括但不局限于：相關(guān)的血管結(jié)扎/夾閉時間點(diǎn)（通常為動脈夾閉時間）來表示體內(nèi)缺血開始（熱缺血）；注：不需要進(jìn)行小組織切片活檢切除冷凍。組織離體的時間、日期及離體方式（例如：核芯針穿刺、切除及其他活檢裝置采樣）；（如果在實驗室外進(jìn)行組織冷凍，則應(yīng)記錄6.2中描述的步驟，需要進(jìn)行病理評估時，應(yīng)執(zhí)行6.3。文件記錄還宜包括標(biāo)本采集人員身份信息ID，能采用編碼的形式。標(biāo)本處理（例如通過內(nèi)窺鏡檢查獲取的活檢標(biāo)本，或者在需要快速冷凍切片診斷的外科手術(shù)過程中從患者身上取出的標(biāo)本）。應(yīng)記錄對離體標(biāo)本所進(jìn)行的任何添加或變動，例如油墨標(biāo)記、縫線、切口等標(biāo)本的方位標(biāo)記。如果標(biāo)本需要進(jìn)行病理診斷，則應(yīng)由具有醫(yī)師資格的病理學(xué)家采樣，或者在其監(jiān)督、指導(dǎo)下進(jìn)行（參見6.2），這些人員宜了解對標(biāo)本的所有檢驗，以保證正確處理。如果在沒有病理診斷要求的情況下取出標(biāo)本，評估標(biāo)本的選擇和記錄可由病理學(xué)家以外的其他有資質(zhì)的人員進(jìn)行。DNAISO20166-3DNARNA都要進(jìn)行檢驗，請參見1S020184-1。DNA（例如甲基化/樣品宜立即冷凍（6.3)。冷凍能在病理學(xué)家的指導(dǎo)或監(jiān)督下，在實驗室外或在實驗室內(nèi)進(jìn)行。如果標(biāo)本或樣品在實驗室外冷凍，立即進(jìn)行6.2。如果標(biāo)本或樣品在實驗室內(nèi)冷凍，則需要將新鮮的組織標(biāo)本運(yùn)送到實驗室。應(yīng)立即執(zhí)行5.2中描述的新鮮組織運(yùn)送的步驟。新鮮組織運(yùn)送要求總則運(yùn)送準(zhǔn)備應(yīng)執(zhí)行以下步驟：選擇和使用容器和包裝（例如冷卻箱、貯存和運(yùn)輸箱、真空包裝）；注1：根據(jù)適用的運(yùn)送規(guī)定。選擇和使用穩(wěn)定程序（例如冷卻方法）進(jìn)行運(yùn)送；注2：意外冷凍新鮮組織（例如以錯誤的方式使用冷包）可能導(dǎo)致組織解凍時DNA降解，還可能影響形態(tài)特征。容器的標(biāo)記（例如注冊號、條形碼、標(biāo)本類型、數(shù)量和等級、來源的器官組織）和其他文件[5.1.2,5.1.3,5.1.4和5.2.2a）和b）]。單個容器可只容納幾個標(biāo)本，如果這些標(biāo)本取自同一部位（即相似或相應(yīng)的解剖后者組織器官部位），并具有相同的大體特征，例如組織類型和疾病狀態(tài)(如炎癥、腫瘤和壞死)。注3：具有相同大體特征的標(biāo)本可能具有不同的分子特征。2℃至DNA（例如碎裂）?；蛘?，根據(jù)預(yù)期的檢驗要求，在室溫下短時間暴露(例如≤3小時)也能接受。在檢驗的開發(fā)過程中，應(yīng)規(guī)定并驗證在規(guī)定溫度范國內(nèi)的最長儲存時間。（8℃估算。運(yùn)送中（例如溫度跟蹤如果標(biāo)本尚未冷凍，宜立即置于冰上或維持溫度在2℃~8℃情況下進(jìn)行即時運(yùn)送，以盡量減少DNA譜的變化。應(yīng)記錄與既定運(yùn)送程序規(guī)程的符合性，并且應(yīng)描述和記錄存在的任何偏離。實驗室內(nèi)部標(biāo)本接收相關(guān)信息應(yīng)記錄標(biāo)本接收人員的姓名（能以編碼形式）、所接收標(biāo)本的到達(dá)日期、時間及狀態(tài)（例如標(biāo)簽、包括溫度在內(nèi)的運(yùn)輸條件、組織類型和標(biāo)本數(shù)量、容器泄漏/破損）。與既定運(yùn)輸程序的任何偏離都應(yīng)記錄（參見5.2）。（參見5.1.1和、住院號和/或捐贈者/患者ID、患者姓名、出生日期和組織類型。對于不符合說明書的情況均應(yīng)記錄，例如標(biāo)簽、貯存和運(yùn)送條件（溫度和持續(xù)時間）、標(biāo)本和泄露/破損的采集容器。標(biāo)本病理學(xué)評估和樣品選擇標(biāo)本病理學(xué)的評估和記錄以及從標(biāo)本中選擇用于進(jìn)一步處理的樣品應(yīng)由具有醫(yī)師資質(zhì)的病理醫(yī)師完成，或在其監(jiān)督或負(fù)責(zé)下完成。當(dāng)?shù)?、國家或地區(qū)法規(guī)能適用。選擇用于DNA檢驗的樣品。用于分子和組織病理學(xué)檢查以及可選的進(jìn)一步研究目的標(biāo)本的適當(dāng)部分的選擇應(yīng)由具有醫(yī)師DNA位。宜對組織進(jìn)行顯微或手工切割以選擇或富集疾病的某些細(xì)胞特征。注1：根據(jù)當(dāng)?shù)爻绦?，?biāo)本的適當(dāng)部分的選擇也能在實驗室外進(jìn)行，例如，在手術(shù)室（參見5.1.4）。在對手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行大體檢查時，應(yīng)在冷凍前和/或冷凍后檢查標(biāo)本的正確身份。宜核對標(biāo)本的臨床信息（.3）（住院號和/或病理學(xué)號和/或供者/患者ID，患者姓名，患者出生日期和組織類型。手術(shù)標(biāo)本和所有發(fā)現(xiàn)應(yīng)根據(jù)各醫(yī)學(xué)會的指南適當(dāng)描述，并與臨床信息和問題相關(guān)聯(lián)。應(yīng)描述標(biāo)本的解剖學(xué)定位，必要時可標(biāo)記切除邊緣和其他重要區(qū)域，有助于以后的顯微鏡評估；可拍攝照片。應(yīng)根據(jù)各醫(yī)學(xué)學(xué)會的器官/疾病相關(guān)指南，獲取有代表性的用于顯微鏡評估的樣品（即大體檢查）。注2：上述評估或記錄也能在實驗室外進(jìn)行，例如：在手術(shù)室。當(dāng)標(biāo)本從體內(nèi)取出而不需要進(jìn)行組織病理學(xué)診斷時，該標(biāo)本的記錄以及樣品的評估、選擇和記錄可由其他合格人員進(jìn)行，而不是病理學(xué)家。（標(biāo)本或樣品的冷凍1）,2）或3）】。小瓶在預(yù)先冷卻之前應(yīng)貼上標(biāo)簽。na-frezngroedre)]CH2-甲基丁烷80℃至＞-160℃，能用于急速冷凍。能使用液氮（-196℃），干冰（-80℃），-80℃冷凍箱或?qū)Ｓ美鋬鲈O(shè)備進(jìn)行預(yù)80（例如玻璃燒杯10倍。對于快速冷凍，組織樣品應(yīng)完全浸沒在預(yù)冷卻的異戊烷中?？焖倮鋬龀绦?fast-freezing80℃至＞-196夾具將金屬板或金屬籃固定到位?；蛘?，樣品能直接在液氮中冷凍，或者在液氮或干冰中的標(biāo)記和封閉的貯存瓶中冷凍。然而，緩慢的冷凍過程能導(dǎo)致膜破裂，因為鹽的濃度升高和晶體形成能嚴(yán)重影響形態(tài)。為避免交叉污染，宜在冷凍樣品之間清洗籃子或盤子。注：在液氮中冷凍的特點(diǎn)是由于其相對較高的溫度，液氮在組織周圍沸騰引起的萊頓弗羅斯特效應(yīng)[11]。這減少了從樣品到液氮的熱傳導(dǎo)；當(dāng)將樣品在冷凍前放入標(biāo)記的小瓶中時，這種情況會變得更糟。快速冷凍切片診斷的組織冷凍程序【另見6.2c)】：組織宜新鮮運(yùn)送到實驗室，不得延誤。標(biāo)本的選定部分應(yīng)放在合適的冷凍介質(zhì)中，冷凍在適合低溫恒溫儀器的專用支撐裝置（例如金屬網(wǎng)格、底座、圓盤）上。應(yīng)記錄使用的冷凍介質(zhì)。含有組織和冷凍介質(zhì)的支撐裝置宜冷凍用冷凍培養(yǎng)基處理的樣品宜貯存在-70℃以避免干燥，在使用每種冷凍介質(zhì)處理樣品前宜先評估DNA的質(zhì)量（參見6.6）。在冷凍程序之前、期間和之后應(yīng)執(zhí)行以下步驟：冷凍程序的記錄（例如在液氮中冷凍，在液氮或干冰冷卻的異戊烷中快速冷凍，在適當(dāng)?shù)睦鋬鼋橘|(zhì)中冷凍，以受控制的冷卻速率冷凍）；（以確定滯后時間：從身體移除之間的時間段-直到標(biāo)本或樣品冷凍）；于低溫貯存的冷凍容器：冷凍容器應(yīng)具有足夠的體積以適應(yīng)保存的標(biāo)本或樣品的大?。焕鋬鋈萜鲬?yīng)經(jīng)過貯存溫度認(rèn)證；冷凍容器應(yīng)安全密封，最好用螺帽固定;不得使用帶翻蓋的容器；注：由于密封不正確，當(dāng)容器存放在液氮中時，管內(nèi)液氮發(fā)生泄漏時，容器能在標(biāo)本或樣品回收時爆炸。確定樣品所需的組織尺寸是否適合冷凍前選定的低溫小瓶，因為組織大小決定了容器的大小;因此，建議標(biāo)本/樣品在一個維度上不超過1標(biāo)簽應(yīng)適合各自的冷凍貯存條件；注：合適的標(biāo)簽[例如自粘標(biāo)簽、手寫、射頻識別（RFID）、預(yù)先標(biāo)記的容器]應(yīng)通過質(zhì)量驗證。容器的標(biāo)簽應(yīng)確保標(biāo)本和樣品的適當(dāng)可追溯性。因此，容器標(biāo)簽應(yīng)提供以下最基本信息：標(biāo)本供者//ID/組織類型，組織和疾病狀況影響（例如腫瘤）或未受影響，除非樣品跟蹤系統(tǒng)能將這些6.3f）1）中使用的標(biāo)本或樣品的識別信息相匹配；每個容器的唯一編號，能括在6.3f）1）中。標(biāo)本或樣品的類型，數(shù)量和描述的文件（例如腫瘤（貯存要求恒溫應(yīng)≤-70℃。宜用監(jiān)測溫度的系統(tǒng)。冷凍機(jī)或液氮罐應(yīng)具有溫度報警系統(tǒng)。在取回標(biāo)本或樣品期間可能發(fā)生嚴(yán)重的溫度變化。因此，檢索時間宜盡可能短，以避免樣品解凍。應(yīng)記錄能使待處理或進(jìn)一步貯存的標(biāo)本或樣品解凍的偶然發(fā)生的溫度變化。宜供備用低溫貯存設(shè)施。應(yīng)記錄從貯存系統(tǒng)中取出任何標(biāo)本或樣品的貯存位置、貯存溫度、時間和日期。DNA總則（（例如在蘇木精/切片上DNA所有能接觸樣品或組織載玻片的材料，包括裂解緩沖液和含有該緩沖液的小瓶，用于操作冷凍樣品進(jìn)行冷凍切片或轉(zhuǎn)移至裂解緩沖液的小瓶和工具應(yīng)清潔且無核酸酶。在使用前，所有材料（不包括裂解緩沖液和含有此緩沖液的小瓶）和用于操作冷凍樣品進(jìn)行冷凍切片并轉(zhuǎn)移至裂解緩沖液的工具應(yīng)冷卻至＜0/形態(tài)學(xué)變化（例如腫瘤含量）DNA（H&E）染色來檢查形態(tài)學(xué)。應(yīng)記錄所使用的方法以及過程中使用的試劑盒和批號；提取的DNA宜保存在冰上或2℃至8℃（例如冷凍頭），并宜立即檢測或長期貯存；為避免DNA檢驗中擴(kuò)增材料的交叉污染，DNA的分離不宜與檢驗過程的擴(kuò)增步驟在同一區(qū)域進(jìn)行，除非使用封閉系統(tǒng)，以避免交叉-污染。如果對標(biāo)本或樣品的正確識別存在疑問，則應(yīng)驗證標(biāo)本/樣品的身份，例如在人類身份檢測中使用的方法，如短串聯(lián)重復(fù)（STR）分析。DNA的分離是診斷工作流程中的關(guān)鍵步驟，在整個工作流程的驗證過程中應(yīng)特別關(guān)注。宜在DNA能力檢測程序中檢測DNA分離性能。使用商品化試劑盒當(dāng)使用專用于從冷凍組織中分離DNA的商品試劑盒時，應(yīng)遵循制造商的使用說明。使用實驗室自建程序如果實驗室使用不同于商品試劑盒的自建程序，則應(yīng)確認(rèn)證明它符合目的，應(yīng)編寫說明并遵守。使用不同制造商的產(chǎn)品能影響結(jié)果，因為產(chǎn)品不必兼容。只有在組件經(jīng)過配套測試并通過預(yù)期檢驗驗證時，它們才宜應(yīng)用于診斷測試。實驗室開發(fā)的冷凍組織切片DNA分離程序宜包含以下步驟：組織切片在裂解緩沖液中重懸。用蛋白酶K消化去除蛋白質(zhì)，并從較大的切片或片段中釋放DNA。對于蛋白酶K消化步驟（例如在55℃至56℃進(jìn)行），宜優(yōu)化裂解緩沖液，然后進(jìn)行蛋白酶K熱滅活步驟，例如在95℃進(jìn)行。注:有些商業(yè)試劑盒和實驗室開發(fā)的蛋白酶K方案可用于從同一組織中依次分離RNA和DNA案往往會導(dǎo)致一些DNA損失并將DNA帶入到RNA提取過程中，并可能影響從一定量組織中提取的預(yù)期DNA產(chǎn)量?？蛇x方案：如需要無RNA的基因組DNA，則與RNaseA一起孵育。注1：當(dāng)使用實驗室開發(fā)的方法時，過量的RNA可能會與DNA共純化，從而可能干擾預(yù)期的檢驗。在這種情況下，可能需要加入RNase消化步驟。注2：即使在消化后，如果消化的RNA片段在DNA純化過程中未被