雜交水稻兩優(yōu)培九抽穗及開花過程中的線粒體結(jié)構(gòu)變化

水稻強(qiáng)和虛弱粒的播種量和豐滿度差異很大，達(dá)到25%左右。弱勢粒約占水稻籽粒的1/3左右(大穗型品種),且隨著穗形的增加,弱勢粒所占的比例更大。由于弱勢粒結(jié)實(shí)率和充實(shí)度較低,極大地限制了水稻高產(chǎn)潛力的發(fā)揮。因此,不少學(xué)者從植物激素及與籽粒灌漿有關(guān)的酶等方面對強(qiáng)、弱勢粒進(jìn)行了一些生理生化特性的研究[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11]。揭示了強(qiáng)、弱勢粒的結(jié)實(shí)率和充實(shí)度差異的一些生理原因。然而關(guān)于強(qiáng)、弱勢粒核酸代謝差異的研究尚未見報道,系統(tǒng)進(jìn)行強(qiáng)、弱勢粒胚乳細(xì)胞形成及上部一次枝梗和下部二次枝梗維管束結(jié)構(gòu)和生理特性與強(qiáng)、弱勢粒的結(jié)實(shí)率和充實(shí)度關(guān)系的研究較少。植物體內(nèi)的功能物質(zhì)——蛋白質(zhì)是由脫氧核糖核酸(DNA)轉(zhuǎn)錄成核糖核酸(RNA),然后再由RNA翻譯而成的。RNA在植物體內(nèi)不能長期存在,發(fā)揮功能后很快被RNA酶降解,RNA含量特別是mRNA含量反映了基因轉(zhuǎn)錄活性的高低。因而強(qiáng)、弱勢粒RNA含量特別是mRNA含量反映了籽粒(庫)活性大小。上部一次枝梗與下部二次枝梗分別是水稻強(qiáng)勢粒和弱勢粒著生的地方,是營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入籽粒的通道,其維管束發(fā)育的好壞直接影響無機(jī)物和有機(jī)物向籽粒的運(yùn)輸,胚乳細(xì)胞的數(shù)目和大小反映了籽粒發(fā)育的狀況。所以探討強(qiáng)、弱勢粒RNA特別是mRNA含量以及上部一次枝梗與下部二次枝梗維管束的結(jié)構(gòu)和生理差異以及強(qiáng)、弱勢粒胚乳細(xì)胞形成的差異,對于了解強(qiáng)勢粒和弱勢粒結(jié)實(shí)率和充實(shí)度的差異具有重要意義。1材料和方法1.1各取材粒的剝削對花穗的剝削和保存水稻(Oryzasativa)品種兩優(yōu)培九(培矮64S/9311)。于單穗抽穗當(dāng)天、第5天、第7天和第12天各取整齊一致的200穗,分別剝?nèi)?qiáng)勢粒(上部3個一次枝梗上抽穗當(dāng)天開花的籽粒,第7天和第12天因其灌漿較多,子房破裂而不取)和弱勢粒(下部3個二次枝梗上除去頂粒,抽穗后7d開花的籽粒)的子房,立即投入液氮,置-70℃冰箱保存。1.2neasymini洗脫按Qiagen公司的RNeasyPlantMiniKit的說明書進(jìn)行。先取100mg樣品放入液氮中研磨成勻漿,后加入450μL的胍基硫氫酸緩沖液,并渦旋振蕩,使核酸酶變性失活,以得到完整的核酸。把樣品液移入QIAshredder旋轉(zhuǎn)柱中,在20℃下18000×g離心2min,上清液中加入225μL的乙醇,提供硅膠膜束縛核酸的條件,把樣品加入到含有硅膠膜的RNeasymini旋轉(zhuǎn)柱中,總RNA吸附到硅膠膜上,用緩沖液洗脫各種污染物。最后用無核糖核酸酶的水把總RNA從RNeasymini旋轉(zhuǎn)柱中洗脫下來。用DU-640核酸蛋白分析儀測定其含量和純度。1.3poli-a與ol空間雜交按Qiagen公司OligtexTMKit說明書進(jìn)行。在250μL的總RNA樣品中加入250μL的OBB緩沖液和15μL的Oligotex懸浮液并混合均勻,在70℃水浴中溫育3min,室溫下放10min,使mRNA的Poly-A與Oligotex粒子雜交,然后在20℃下以18000×g離心2min,以沉淀oligotex-mRNA復(fù)合物。用400μL的OW2緩沖溶液重新懸浮oligotex-mRNA并轉(zhuǎn)移到一個小旋轉(zhuǎn)柱中,在20℃下以18000×g離心1min,重復(fù)此步驟1次。最后加OEB緩沖液于小旋轉(zhuǎn)柱中,在20℃下以18000×g離心1min,把mRNA從oligotex-mRNA中洗脫下來。1.4弱勢粒和弱勢粒房或胚乳于抽穗當(dāng)天、抽穗后3d及強(qiáng)、弱勢粒乳熟期,從整齊一致的穗上分別剝?nèi)?qiáng)勢粒和弱勢粒子房或胚乳;于抽穗當(dāng)天、抽穗后15d,從整齊一致的穗上取上部一次枝梗和下部二次枝梗,制成石蠟切片,于Olympus顯微鏡上觀察攝影,記錄胚乳細(xì)胞的數(shù)目,用目鏡測微尺測量維管束導(dǎo)管和韌皮部的面積。1.5水浴加熱處理取0.5g樣品粉末,置50mL三角瓶中,加40mL的蒸餾水,80℃水浴中處理30min,過濾至50mL容量瓶中,定容。吸取提取液1mL放入10mL潔凈試管,加蒽酮試劑5mL,混勻,冷卻,用721型分光光度計在625nm波長下測定其含量。1.6蛋白質(zhì)提取液的制備準(zhǔn)確稱取水稻強(qiáng)弱勢粒子房0.5g,放入研缽,加2mL0.1mol/LNaOH,研磨成勻漿,轉(zhuǎn)入10mL離心管,再用6mL0.1mol/LNaOH分3次洗滌研缽,洗液一并轉(zhuǎn)入10mL離心管,用玻棒攪拌,放置30min,其間攪拌數(shù)次,3500r/min離心15min,上清液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶,用蒸餾水定容至刻度,搖勻,得蛋白質(zhì)提取液。吸取提取液0.1mL,放入10mL具塞刻度玻璃試管,加5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑,混勻,放置2min,用10mm光徑的比色杯在595nm波長下用DU-640核酸蛋白分析儀比色,記錄OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白質(zhì)的含量。2結(jié)果與分析2.1形態(tài)不良反應(yīng)發(fā)生情況從表1可知,提取的總RNA、mRNA純度都達(dá)1.9以上,達(dá)到了兩者的純度要求。水稻抽穗當(dāng)天,強(qiáng)勢粒中總RNA、mRNA含量都高于弱勢粒,抽穗后第5天,強(qiáng)勢粒中總RNA含量仍然高于弱勢粒,mRNA含量兩者差異不大,開花當(dāng)天(強(qiáng)勢粒抽穗當(dāng)天,弱勢粒抽穗后第7天)和開花后第5天(強(qiáng)勢粒抽穗后第5天,弱勢粒抽穗后第12天),強(qiáng)勢粒中總RNA、mRNA含量和單粒含量都高于弱勢粒。強(qiáng)勢粒抽穗后0~5d(即開花后0~5d)總RNA、mRNA含量變化不大。弱勢粒抽穗后0~5d,總RNA含量顯著上升,mRNA含量變化不大。5~7d,總RNA,mRNA含量進(jìn)一步增加。7~12d(即開花后0~5d),總RNA、mRNA含量都有所下降。不論是強(qiáng)勢粒還是弱勢粒,從抽穗、開花到開花后5d,其總RNA、mRNA和單粒含量都有顯著的增加。2.2抽穗和湖乳的發(fā)育進(jìn)程和結(jié)構(gòu)觀察水稻的胚乳細(xì)胞是其灌漿物質(zhì)的儲藏單位,籽粒的灌漿生長以胚乳細(xì)胞的增殖和充實(shí)為基礎(chǔ),胚乳細(xì)胞的發(fā)育狀況對稻米品質(zhì)和產(chǎn)量有決定性的影響。強(qiáng)、弱勢粒胚乳細(xì)胞的結(jié)構(gòu)如圖1。實(shí)驗(yàn)表明,水稻的強(qiáng)、弱勢粒胚乳細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程和結(jié)構(gòu)有較大的差異。抽穗當(dāng)天,強(qiáng)勢粒已經(jīng)開花受精,子房開始膨大,而弱勢粒尚未開花受精,子房尚未膨大,抽穗后第3天,強(qiáng)勢粒子房進(jìn)一步膨大,胚囊中已形成較多的胚乳細(xì)胞,而弱勢粒仍未開花受精,子房仍未膨大(圖略)。抽穗后20d,強(qiáng)勢粒已經(jīng)乳熟,而弱勢粒尚處于灌漿期,抽穗30d后才達(dá)到乳熟,取乳熟的強(qiáng)勢粒和弱勢粒,剝?nèi)∨呷?分中部、腹部和背部制成石蠟切片,并顯微攝影,觀察到無論是中部、腹部或背部,強(qiáng)勢粒胚乳細(xì)胞較多,體積較小,細(xì)胞壁較厚,而弱勢胚乳細(xì)胞較大,細(xì)胞壁較薄,數(shù)目較少。強(qiáng)勢粒中部一個縱剖面胚乳細(xì)胞數(shù)平均為245,弱勢粒為186,強(qiáng)勢粒比弱勢粒要多32%,而單個細(xì)胞剖面面積要小32%(如圖1)。2.3兩優(yōu)培九上、下二次枝梗維管束結(jié)構(gòu)水稻籽粒的充實(shí)有賴于源(主要為葉片)的供應(yīng)能力和庫(籽粒)吸收光合產(chǎn)物的能力以及它們的橋梁——流(維管束系統(tǒng))的通暢程度,三者缺一不可。現(xiàn)測得雜交水稻兩優(yōu)培九枝梗微管束特征如表2。從表2可知,上部一次枝梗大維管束數(shù)目與下部二次枝梗大維管束數(shù)目相等,均為1,但導(dǎo)管面積和韌皮部面積均為上部一次枝梗大維管束大于下部二次枝梗大維管束;而小維管束數(shù)目和小維管束韌皮部面積則上部一次枝梗小于下部二次枝梗,小維管束導(dǎo)管面積則上部一次枝梗大于下部二次枝梗。上部一次枝梗大小維管束導(dǎo)管面積之和和韌皮部面積之和都大于下部二次枝梗。由于本實(shí)驗(yàn)所取枝梗為上部一次枝梗頂端負(fù)擔(dān)2個籽粒和下部二次枝梗負(fù)擔(dān)2個籽粒的部分,它們所負(fù)擔(dān)的籽粒數(shù)相等,可見上部一次枝梗維管束與下部二次枝梗維管束相比具有量的優(yōu)勢。當(dāng)然,僅有量的優(yōu)勢是不夠的,還必須具有質(zhì)的優(yōu)勢才能真正有利于無機(jī)物和有機(jī)物的運(yùn)輸。雜交水稻兩優(yōu)培九上部一次枝梗和下部二次枝梗維管束結(jié)構(gòu)如圖2。從圖2可知,上部一次枝梗維管束導(dǎo)管、篩管和伴胞都很清晰,單個導(dǎo)管、篩管和伴胞面積較大,而下部二次枝梗維管束導(dǎo)管、篩管和伴胞則較模糊,單個導(dǎo)管、篩管和伴胞面積較小?？梢?上部一次枝梗維管束、導(dǎo)管、篩管都比下部二次枝梗發(fā)育得好,分化程度高,具有質(zhì)的優(yōu)勢。2.4可溶性糖含量變化可溶性糖是枝梗維管束運(yùn)輸?shù)闹饕镔|(zhì),蛋白質(zhì)是細(xì)胞的功能物質(zhì)。兩者的含量反映了枝梗細(xì)胞的物質(zhì)代謝狀態(tài)(表3)。從表3可知,上部一次枝?？扇苄蕴呛砍樗氘?dāng)天較低,0~10d迅速上升,10~20d有所下降,20~40d又逐漸上升;下部二次枝梗可溶性糖含量抽穗當(dāng)天很低,0~10d有所上升,10~20d迅速上升,20~30d有所下降,30~40d明顯上升。灌漿初期上部一次枝梗可溶性糖含量高于下部二次枝梗,成熟期低于下部二次枝梗。分析表明,枝?？扇苄蕴呛颗c籽粒灌漿動態(tài)及維管束活性有密切關(guān)系,抽穗當(dāng)天,由于強(qiáng)勢粒尚未灌漿,流經(jīng)上部一次枝梗維管束的可溶性糖較少,故含量較低。抽穗后10d,由于強(qiáng)勢粒迅速灌漿,流經(jīng)上部一次枝梗維管束的可溶性糖很多,故含量很高,10~30d強(qiáng)勢粒灌漿減少,流經(jīng)上部一次枝梗維管束的可溶性糖減少,此時雖有少量的糖滯留其中,但與灌漿初期上部一次枝梗維管束內(nèi)運(yùn)輸?shù)拇罅康目扇苄蕴窍啾?其含量降低。30~40d少量的可溶性糖在源端壓力的驅(qū)動下,經(jīng)上部一次枝梗繼續(xù)向強(qiáng)勢粒運(yùn)輸,然而,此時強(qiáng)勢粒吸引可溶性糖的活力較低,上部一次枝梗對可溶性糖運(yùn)輸?shù)淖枇Τ蔀閺?qiáng)勢粒灌漿的限制因子,可溶性糖便在上部一次枝梗中積累起來。所以其可溶性糖含量上升。下部二次枝?？扇苄蕴呛恳泊嬖陬愃频那闆r,0~20d隨著弱勢粒灌漿強(qiáng)度的增加,其含量逐漸上升,20~30d有所下降,30~40d弱勢粒吸引可溶性糖的活力較低,可溶性糖便在下部二次枝梗中積累起來,所以其可溶性糖含量上升。由于下部二次枝梗維管束發(fā)育不良,對有機(jī)物運(yùn)輸?shù)淖枇Ω?所以可溶性糖含量更高。說明成熟期可溶性糖含量反映了上部一次枝梗和下部二次枝梗維管束對有機(jī)物的運(yùn)輸能力。從表3還可知,上部一次枝梗與下部二次枝梗從抽穗期到成熟期蛋白質(zhì)含量都呈下降趨勢,各時期上部一次枝梗蛋白質(zhì)含量都低于下部二次枝梗。上部一次枝梗維管束發(fā)育較好,導(dǎo)管和韌皮部面積較大,薄壁細(xì)胞面積較小。導(dǎo)管是特化的死細(xì)胞,僅存細(xì)胞壁,無細(xì)胞質(zhì),蛋白質(zhì)含量自然很低,為非質(zhì)體,有利于水和礦物質(zhì)的運(yùn)輸。韌皮部主要由篩管組成,篩管細(xì)胞無細(xì)胞核,僅存部分細(xì)胞質(zhì),蛋白質(zhì)含量可能也較低,有利于有機(jī)物的運(yùn)輸。而薄壁細(xì)胞為活的細(xì)胞,代謝較旺盛,蛋白質(zhì)含量較高。由于上部一次枝梗導(dǎo)管和篩管面積較大,且發(fā)育較好,薄壁細(xì)胞總面積較小,所以各時期蛋白質(zhì)含量都低于下部二次枝梗。說明蛋白質(zhì)含量高,意味著維管束發(fā)育不良,不利于無機(jī)物和有機(jī)物的運(yùn)輸。3形態(tài)變異的原因從本研究可知,水稻強(qiáng)弱勢粒核酸代謝存在著差異。抽穗當(dāng)天,強(qiáng)勢粒總RNA、mRNA含量都高于弱勢粒,說明強(qiáng)勢粒抽穗后,與籽粒灌漿有關(guān)的基因優(yōu)先大量轉(zhuǎn)錄,翻譯出與籽粒灌漿有關(guān)的蛋白質(zhì)(酶),所以強(qiáng)勢粒庫活性高,灌漿較早,結(jié)實(shí)率和充實(shí)度較高;而弱勢粒則相反,抽穗后,由于沒有立即啟動與籽粒灌漿有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄,不能產(chǎn)生相應(yīng)的功能蛋白質(zhì)(酶),所以弱勢粒庫活性升高較晚,灌漿較遲,結(jié)實(shí)率和充實(shí)度較低。強(qiáng)勢粒之所以能優(yōu)先啟動與灌漿有關(guān)的基因表達(dá),與其開花受精較早有關(guān),強(qiáng)勢粒抽穗當(dāng)天即開花受精,由于受精作用,啟動了新的基因轉(zhuǎn)錄,而弱勢粒開花受精作用要晚7d左右,其啟動與灌漿作用有關(guān)的基因表達(dá)較遲,此時,水稻群體相對衰弱,源的供應(yīng)不足。這種基因表達(dá)的時序差異導(dǎo)致籽粒灌漿期的營養(yǎng)差異是強(qiáng)弱勢粒結(jié)實(shí)率和充實(shí)度差異的重要原因。開花當(dāng)天和開花后第5天,強(qiáng)勢粒中總RNA、mRNA含量和單粒含量都顯著高于弱勢粒,說明強(qiáng)勢粒開花受精后基因表達(dá)的強(qiáng)度高,能產(chǎn)生較多與籽粒灌漿有關(guān)的功能蛋白質(zhì),所以庫(籽粒)活性高,吸引營養(yǎng)物質(zhì)的能力強(qiáng)。這種基因表達(dá)的強(qiáng)度差異是導(dǎo)致強(qiáng)、弱勢粒結(jié)實(shí)率和充實(shí)度差異的又一原因。張祖建等研究表明,弱勢粒的充實(shí)主要受制于胚乳細(xì)胞數(shù)目。楊建昌等研究表明,在品種(組合)內(nèi),胚乳重和籽粒充實(shí)度與胚乳細(xì)胞數(shù)呈極顯著的正相關(guān),與單個胚乳細(xì)胞重相關(guān)不顯著。推測弱勢粒胚乳細(xì)胞少,發(fā)育不良,灌漿初期生理活性低是其結(jié)實(shí)率和充實(shí)度低的重要原因。本研究表明,強(qiáng)勢粒比弱勢粒受精早7d左右,其胚胎發(fā)育進(jìn)程也較早,最終胚乳細(xì)胞數(shù)也較多,然而細(xì)胞體積較小,細(xì)胞間隙也較小,籽粒灌漿的物理障礙較小,故結(jié)實(shí)率和充實(shí)度較高。從本研究可知,兩優(yōu)培九上部一次枝梗維管束與下部二次枝梗維管束相比發(fā)育較好,導(dǎo)管、篩管和伴胞都分化程度高,導(dǎo)管面積和韌皮部面積以及單個導(dǎo)管、篩管和伴胞都較大,而下部二次枝梗維管束導(dǎo)管、篩管和伴胞則較模糊,單個導(dǎo)管、篩管和伴胞都較小。特別是伴胞對物質(zhì)的運(yùn)輸可能起著的重要作用,它和篩管都起源于單個形成層細(xì)胞,與篩管關(guān)系密切,有許多分枝的胞間連絲相連,具有相對稠密的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,液泡較小,線粒體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富,能以ATP的形式向篩管提供能量,這些能量在推動有機(jī)物在韌皮部運(yùn)輸中起重要作用。另外,伴胞還能把葉肉細(xì)胞產(chǎn)生的同化產(chǎn)物傳遞到篩管。因而伴胞可能在有機(jī)物韌皮部裝載和運(yùn)輸中起重要作用。有些伴胞具有許多內(nèi)生生長的細(xì)胞壁,大大增加了細(xì)胞膜的表面積,促進(jìn)同化物從葉肉細(xì)胞轉(zhuǎn)移到篩管。上部一次枝梗維管束與下部二次枝梗維管束相比由于具有較多發(fā)育良好的導(dǎo)管、篩管和伴胞,所以強(qiáng)勢粒結(jié)實(shí)率和充實(shí)度都較高。從本研