四逆湯組方中附子配伍毒理學安全性研究

四逆湯是回陽救陽的代表湯，有許多簡化和切割的處方，臨床應用廣泛。四逆湯由附子、干姜、甘草3味藥物組成,其中附子為有毒中藥。本實驗通過拆方分析,比較研究附子與甘草或干姜的配伍對于附子毒性以及附子中的毒性成分的影響,從毒理學角度探討四逆湯處方配伍的合理性。1實驗材料1.1加工品和栽培根附子(黑順片):產(chǎn)地四川,批號110106061,經(jīng)同仁堂研究院遲玉明研究員鑒定為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的子根的加工品;甘草:產(chǎn)地甘肅,批號110107051,經(jīng)同仁堂研究院遲玉明研究員鑒定為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖;干姜:產(chǎn)地四川,11051201,經(jīng)同仁堂研究院遲玉明研究員鑒定為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根莖。均購自北京仁衛(wèi)飲片廠。1.2對照品的制備烏頭堿(含量測定用,批號110720-200410)、次烏頭堿(含量測定用,批號110798-200805)、新烏頭堿(含量測定用,批號110799-200404)、苯甲酰烏頭原堿(含量測定用,批號111794-200901)、苯甲酰次烏頭原堿(含量測定用,批號111796-200901)、苯甲酰新烏頭原堿(含量測定用,批號111795-200901),以上對照品均購于中國藥品生物制品檢定所。乙腈及四氫呋喃為色譜純,其余試劑為分析純;液相色譜用水為超純水(自制,0.45μm濾膜濾過)。1.3逆湯配方組方受試藥物分為附子單煎液、附子+甘草配伍煎液、附子+干姜配伍煎液、四逆湯全方煎液4種樣品溶液。附子單煎液:加6倍量水浸泡45min,水沸騰后第1次煎煮30min,第2次加5倍量沸水煎煮30min。4層紗布過濾,合并2次煎液,將濾液水浴(70℃)濃縮至所需濃度,置冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩Ｋ哪鏈郊捌浣M方(附子+甘草、附子+干姜)配伍比例依據(jù)四逆湯處方配伍比例進行配伍。四逆湯:附子+甘草+干姜=5∶2∶3;附子+炙甘草組方:附子∶甘草=5∶2;附子+干姜組方:附子∶干姜=5∶3。藥物制備方法同附子單煎液。1.4高效液相色譜法6道生理記錄儀(美國BIOPAC公司生產(chǎn)),Agilent1200高效液相色譜儀,AdventurerTMAR1140電子天平(0.0001g),METTLERTOLEDOAB135-S電子天平(0.01mg)。1.5實驗動物及條件ICR小鼠,SPF級,18~22g;SD大鼠,SPF級,200~250g。實驗動物購自北京大學醫(yī)學部,動物合格證號:SCXK(京)2006-0008,飼養(yǎng)條件:動物房實驗設施為屏障系統(tǒng),溫度20~24℃,相對濕度為40%~70%,人工光照,12h明暗周期。動物飼料為大、小鼠標準顆粒飼料。2實驗方法2.1附子實驗劑量設計急性毒性實驗參考新藥研發(fā)的安全性評價指導原則進行,具體如下:在進行正式實驗前先進行附子的小鼠急性毒性預實驗,得到導致小鼠全部死亡的劑量和動物全部存活劑量。以附子預實驗結果為依據(jù),附子實驗劑量以高于預實驗動物全部致死劑量和低于動物全部存活劑量為實驗劑量范圍的上限和下限劑量,以組間距為0.8,設置附子不同劑量組。附子配伍組中的附子劑量以所含的附子原藥材量計,劑量設置完全等同于單用附子組的劑量。動物購入后,先適應性喂養(yǎng)3d。實驗當日,按體質量隨機分組,每組10只。服藥前小鼠先禁食16h,灌胃給藥1次,給藥最大體積不超過40mL/kg體質量,給藥后密切觀察動物的毒性反應情況,連續(xù)觀察14d。根據(jù)各組動物死亡情況,采用Bless法計算半數(shù)致死劑量(LD50)。2.2急性毒性試驗心臟毒性采用文獻方法,SD大鼠購入后適應性喂養(yǎng)5d,在實驗前禁食不禁水16h,稱體質量,按體質量用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉,將動物仰面固定,使用BIOPAC生物信號采集系統(tǒng)記錄動物心電圖狀況,正向電級插入動物右上肢,負向電級插入動物左下肢,地線接右下肢,連續(xù)觀察10min,心電圖有異常者棄用。實驗動物腹部75%酒精消毒,腹白線剪開動物腹腔,從胃幽門部進針,十二指腸注射給藥,2mL/100g體質量。附子給藥劑量范圍的選定方法及組間距均同上述小鼠急性毒性試驗。給藥后,使用BIOPAC生物信號采集系統(tǒng)連續(xù)觀察60min,以心臟出現(xiàn)各類型的心律失常為心臟中毒的陽性觀察觀察指標。每個劑量組8只動物,計算每組動物半數(shù)中毒劑量(TD50)。2.3附子毒性成分的測定2.3.1流動相a,b色譜柱:AlltimaC18(4.6mm×250mm,5μm);流動相:以乙腈-四氫呋喃(25∶15)為流動相A,以0.1mol/L醋酸銨(每1000mL含冰醋酸0.5mL)為流動相B。梯度洗脫程序:0min,15%A;48min,24%A;49min,35%A;58min,35%A。流速1.0mL/min;柱溫:35℃;檢測波長為235nm。2.3.2混合溶液配制精密稱取烏頭堿9.41mg、新烏頭堿12.05mg、次烏頭堿9.03mg、苯甲酰烏頭原堿12.61mg、苯甲酰新烏頭原堿9.03mg、苯甲酰次烏頭原堿11.82mg分別置于100mL容量瓶中,用乙腈-0.05%乙酸水(30∶70)的混合溶液溶解并定容至刻度。2.3.3對照品溶液的制備分別精密量取各對照品溶液1mL,置于10mL容量瓶中,用乙腈-0.05%乙酸水(30∶70)的混合溶液溶解并定容至刻度,搖勻,得到烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿濃度分別為9.41、12.05、9.03、12.61、9.03、11.82μg/mL混合對照品溶液。2.3.4-氨基-4-3-甲基苯基-1,4,5,5-四甲基-3,5,5-四甲基-5,5,5-四甲基-2,5,5,5-四甲基-2,5,5,5-四甲基-5,5,5-四甲基-5,5,5-四甲基-5,5,10,10,10,10,10,10,10,10,10.10,10.7,10.7,10.10,10.7-四甲基-10,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7,10.7-四甲基-10,10.7,10.7-四甲基-10,10.5%7-羥基甲基-6-羥基甲基-5-甲基-10,10.5%7-羥基甲基-6-甲基-5-甲基-10,10.5%7-羥基甲基-6-羥基甲基-5-甲基-5-甲基-10-甲基-10-甲基-10,10.7,10.7,10.7-甲基-10-甲基-10,10.5%7-羥基甲基-6-甲基-10,10.5%7-羥基甲基-6-甲基-10,10.5%10.5%7-羥基甲基-6-甲基-10,10.5%10.5%10.5%7-羥基甲基-6-甲基-10,10.5%10.5%10.5%7-羥基甲基-6-甲基-10,10.5%10.5%10.5%7-羥基甲基-6-甲基-10,10.5%10.5%10.5%7-羥基甲基-6-甲基-5-甲基-10,10.5%10.5%10.5%10.5%7-羥基甲基-6-羥基甲基-6-羥基甲基-6-甲基-5-甲基-5-甲基-10,10.5%10.5%10.5%附子單煎液、四逆湯全方煎煮液及附子分別配伍甘草和干姜的混煎液的制備同于上述配伍減毒實驗藥物制備。分別量取相當于附子0.5g的樣品溶液(陰性樣品量取相當于附子0.5g的溶液),加水稀釋至10mL,加入3倍量的乙醇,醇沉過夜,濾過,減壓濃縮(60℃)至無醇味,用稀鹽酸20mL溶解,乙醚振搖提取2次,每次20mL,棄去乙醚液,水液用濃氨水調(diào)pH值至9~10,用二氯甲烷振搖提取3次(20、10、10mL),合并二氯甲烷液,60℃蒸干,殘渣用乙腈-0.05%乙酸水(30∶70)的混合溶液溶解,轉移至5mL量瓶中,并稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。2.3.5測量3結果3.1附子配伍甘草對動物毒性的影響附子急性毒性表現(xiàn):呼吸困難,喘氣,繼而出現(xiàn)驚厥死亡。實驗中部分動物嘔吐白沫,逐漸呼吸停止死亡。動物死亡多發(fā)生在給藥15~180min。附子不同配伍給藥后動物毒性表現(xiàn)與單用附子類似,但四逆湯全方、附子配伍甘草可明顯提高附子的LD50,而附子配伍干姜的LD50與單用附子接近。結果見表1。3.2附子與單用附子的比較附子心臟毒性主要表現(xiàn)為心律失常(出現(xiàn)異常的QRS波),心律失常主要出現(xiàn)在給藥20~45min,附子不同組方配伍的毒性表現(xiàn)與單用附子類似。同單用附子比較,四逆湯、附子配伍甘草均可以不同程度地提高大鼠心臟毒性的半TD50,而附子配伍干姜TD50低于單用附子。結果見表2。3.3種樣品中治療前后東南角堿的測定附子單煎液、附子+甘草配伍煎液、附子+干姜配伍煎液、四逆湯全方煎液4種樣品溶液中均未檢出烏頭堿。與附子單煎液比較,附子與甘草配伍煎液、附子與干姜配伍煎液,以及四逆湯全方煎液中的各類烏頭堿含量均降低。附子配伍甘草煎液中的雙酯型生物堿含量低于附子配伍干姜煎液。結果見表3。4逆湯及其一、事四逆湯組方的合理性以往多從藥效學角度進行研究,從而說明其在藥效學上組方的科學性,而本實驗則是從毒理學角度進行研究以期闡述其配伍的安全性。四逆湯組方中的君藥附子為有毒中藥,附子主要的毒性靶器官是心臟,附子臨床主要的毒性特征也是各種類型的心律失常,附子中生物堿類成分和單酯型二萜生物堿既是附子主毒性成分又是其藥效成分。因此,本研究在進行四逆湯拆方配伍減毒的實驗中,從急性毒性、心臟毒性(靶器官毒性)和毒性成分3個方面進行了附子配伍減毒的研究。結果顯示,與單用附子相比較,附子配伍甘草組和四逆湯全方能夠明顯地降低附子的毒性,提高LD50和TD50。從毒理學的角度來看,上述附子配伍實驗中的急性毒性和心臟毒性結果具有較好的一致性,而附子配伍干姜對附子毒性的影響則不甚明顯,甚至在心臟毒性實驗中,附子配伍干姜組其TD50低于單用附子,表明干姜不僅不能拮抗附子的毒性,反而有可能增加附子的心臟毒性。然而,在急性毒性實驗中,附子和干姜的配伍并沒有這種增毒現(xiàn)象。結果提示,四逆湯中甘草在制約和拮抗附子毒性方面起著主要作用,而干姜很可能在藥效學方面起著配伍增效的作用而不是在配伍減毒方面發(fā)揮作用。附子的雙酯型生物堿如烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿是其主要毒性成分,單酯型二萜生物堿如苯甲酰烏頭堿、苯甲酰中烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿等毒性較雙酯堿小得多。在四逆湯及其附子不同配伍煎液中均未測到烏頭堿;除了烏頭堿之外,與附子單煎組液比較,四逆湯全方以及附子配伍甘草或干姜的2個混煎組中的各類烏頭堿含量均有不同程度的降低;從單酯鏈型生物堿含量來看,各配伍組也都低于附子單煎液;此外,附子和甘草配伍組與附子與干姜配伍組比較,二者之間的區(qū)別并不明顯,但從雙酯型生物堿的含量來看,附子配伍甘草煎液中所含有的雙酯型生物堿(次烏頭堿)含量低于附子配伍干姜,這一結果似乎也支持四逆湯組方配伍中附子配伍甘草的減毒作用明顯優(yōu)于附子配伍干姜的作用。附子配伍甘草煎液中烏頭堿類生物堿含量的下降有可能與堿性堿和甘草中酸性甘草次酸在煎煮過程中發(fā)生中和反應有關,二者形成沉淀導致水煎液烏頭堿