花椒抑菌活性成分提取工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究

青椒是蝗蟲(chóng)科植物的干燥成熟果皮。它具有加熱和促進(jìn)陽(yáng)光、散寒除濕、補(bǔ)氣止痛、殺蟲(chóng)止癢和抗氧味道的功效。不僅可以作為中藥材,而且是一種具有麻香味的調(diào)味食用香料,在食品添加劑領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用,被譽(yù)為“八大味”之一?；ń返幕瘜W(xué)成分主要有揮發(fā)油、生物堿、黃酮類、香豆素等。它們是各種植物中常見(jiàn)的對(duì)食品中腐敗菌及致病菌具有抑制效果的化學(xué)成分,花椒將成為食品天然防腐劑的重要來(lái)源之一。本研究選取花椒為原料,對(duì)花椒中抑菌活性成分的提取條件進(jìn)行研究,為花椒資源在食品天然防腐劑中的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。1青椒中抗菌活性物質(zhì)提取及實(shí)驗(yàn)1.1供試菌種原料與試劑:花椒、乙醇、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、生理鹽水、蔗糖、葡萄糖、NaCl等。供試菌種:金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、黃曲霉、啤酒酵母。主要儀器:電熱鼓風(fēng)干燥器、生化培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、超凈臺(tái)、立式壓力蒸汽滅菌器、高速離心機(jī)等。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1青椒提取活性成分準(zhǔn)確稱取花椒,粉碎,然后與乙醇溶液混合,常溫浸提,抽濾,合并濾液減壓蒸餾,除去乙醇,并濃縮,制成1g/mL的花椒乙醇浸提液。1.2.2培養(yǎng)基的制備無(wú)菌條件下將滅菌的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)的供試菌種制成菌懸液,然后注入相應(yīng)的培養(yǎng)皿中,使菌液分布均勻。將浸入提取原液的濾紙片稍晾干后放入培養(yǎng)皿,每皿正三角形放置3片,與培養(yǎng)基完全接觸。每份樣品平行接種3個(gè)培養(yǎng)皿。培養(yǎng)箱培養(yǎng),細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24h,霉菌于28℃培養(yǎng)48h,酵母30℃,培養(yǎng)24h,取出觀察,用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈的直徑(mm),求平均值。1.2.3空白對(duì)照組的設(shè)計(jì)取若干只滅菌試管,順序編號(hào),以適合供試菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基將被測(cè)的花椒提取物進(jìn)行一系列對(duì)倍稀釋,濃度分別為100,50,25,12.5,6.25,3.125,1.56g/L,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。各試管加入菌懸液50μL,培養(yǎng)箱培養(yǎng),細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24h,霉菌于28℃培養(yǎng)48h,酵母30℃,培養(yǎng)24h,取出觀察判定結(jié)果,以含藥量低而無(wú)肉眼可見(jiàn)菌生長(zhǎng)的一管含藥量為藥物對(duì)該菌的MIC。1.2.4抑菌圈測(cè)定以金黃色葡萄球菌為指示菌,將花椒提取物分別置于40,60,80,100℃水浴和121℃濕熱條件下,熱處理30min,對(duì)照樣置于30″C,用濾紙片法來(lái)測(cè)定其抑菌圈,試驗(yàn)重復(fù)3次。2結(jié)果與分析2.1花椒抑菌活性成分最佳提取條件的確定在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時(shí)間各因素的最優(yōu)試驗(yàn)范圍,研究按照表1的因素水平表,選擇L9(34)正交表進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn),根據(jù)抑菌圈直徑(金黃色葡萄球菌),確定花椒抑菌活性成分最佳提取條件。結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,影響抑菌圈直徑(金黃色葡萄球菌)的因素順序?yàn)?浸提溫度>液料比>乙醇濃度>浸提時(shí)間;最佳提取條件為A1B2C2D2,即乙醇濃度55%、浸提溫度60℃、浸提時(shí)間3h、料液比1∶15。2.2抑菌圈直徑測(cè)定最佳提取條件下,花椒提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、黃曲霉、啤酒酵母的抑菌圈直徑見(jiàn)表3,由此可以看出花椒提取物對(duì)細(xì)菌、霉菌和釀酒酵母都有很強(qiáng)的抑制效果,其抗菌譜較寬。2.3對(duì)細(xì)菌和黑曲霉、啤酒酵母的mic花椒提取物對(duì)供試菌的MIC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。從表中結(jié)果可以看出,花椒提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和黃曲霉的MIC為3.125g/L,對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的MIC為6.25g/L,對(duì)黑曲霉和啤酒酵母的MIC為12.5g/L。由此可知,花椒對(duì)供試菌有較強(qiáng)的抑制作用。2.4花椒提取物抑菌活性測(cè)定以金黃色葡萄球菌為指示菌,測(cè)定不同溫度下仙人掌提取物的抑菌活性。結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出,花椒提取物經(jīng)不同溫度處理后抑菌活性差別不大,基本保持原有的抑菌活性,即使在121℃處理30min后仍具有較高活性。這表明花椒提取物的抑菌活性具有較好的熱穩(wěn)定性。3花椒提取物的抗菌性能采用濾紙片法,以抑菌圈直徑為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),金黃色葡萄球菌為指示菌,優(yōu)化提取工藝。通過(guò)正交試驗(yàn)得出最佳提取工藝條件為:乙醇濃度55%、浸提溫度60℃、浸提時(shí)間3h、料液比1∶15。對(duì)花椒提取物做了抗菌譜的測(cè)定,結(jié)果表明具有較寬的抗菌譜?；ń诽崛∥飳?duì)金黃色葡萄球菌和黃曲霉的MIC為3.1