類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶的研究進(jìn)展

21世紀(jì)以來，由于胚胎透明、發(fā)育迅速、后代眾多，斑點(diǎn)魚逐漸成為遺傳發(fā)育研究領(lǐng)域的重要模式生物。然而,由于斑馬魚的胚胎干細(xì)胞(ES)技術(shù)不夠成熟,因此還無法像小鼠那樣通過ES途徑進(jìn)行基因打靶。最近十幾年來,人們始終在不遺余力地嘗試通過各種途徑在斑馬魚中制備/篩選突變體,并且已陸續(xù)建立了多種方法,例如,ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)化學(xué)誘變、TILLING(TargetingInducedLocalLesionsINGenomes)、反轉(zhuǎn)錄病毒插入誘變、基因誘捕(Genetrap)和ZFN(Zincfingernuclease)介導(dǎo)的定點(diǎn)突變等。但是這些方法都有各自的局限性,還沒有一種能夠?qū)崿F(xiàn)對斑馬魚的任意基因進(jìn)行靶向修飾。直到2009年,有兩組科研人員同時(shí)揭示了來自植物病原菌——黃單胞桿菌(Xanthomonasspp.)中TALE(Transcriptionactivator-likeeffector)家族的蛋白結(jié)構(gòu)單元與DNA靶序列之間存在一一對應(yīng)的特異性識別并結(jié)合的秘密,基因組定點(diǎn)突變技術(shù)才打開了新的局面。迄今僅短短3年的時(shí)間,人們已經(jīng)利用TALE蛋白這種特殊的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域跟FokⅠ核酸酶結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)成人工TALE核酸酶(TALEnuclease,簡稱TALEN),建立了理論上能夠?qū)θ我馕锓N進(jìn)行基因打靶的新技術(shù),并且成功地在體外培養(yǎng)的人類細(xì)胞、線蟲、斑馬魚、大鼠、果蠅等17個(gè)物種中實(shí)現(xiàn)了基因組定點(diǎn)突變(詳見本期另文發(fā)表的綜述“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)”)。由于斑馬魚的反向遺傳學(xué)技術(shù)相對于果蠅、線蟲等經(jīng)典模式動(dòng)物而言更亟待完善,因此,TALEN技術(shù)的建立對于斑馬魚研究領(lǐng)域更有著不同尋常的意義。TALEN技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵步驟之一是TALEN表達(dá)載體的構(gòu)建。天然TALE蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核心部分一般由1.5~33.5個(gè)基本重復(fù)單元(Repeatunit)串聯(lián)而成,其中每個(gè)單元包含34個(gè)左右的氨基酸殘基。每個(gè)重復(fù)單元中第12位和13位的氨基酸殘基稱為重復(fù)可變雙殘基(Repeatvariabledi-residue,簡稱RVD),它決定了該單元識別DNA堿基的特異性。常用的RVD包括NI(AsnIle)、HD(HisAsp)、NG(AsnGly)和NN(AsnAsn),分別對應(yīng)識別堿基A、C、T和G。目前人們已報(bào)道了多種方法用于構(gòu)建TALE串聯(lián)重復(fù)序列(TALErepeats),其中“單元組裝法”(UnitAssembly,UA)是本實(shí)驗(yàn)室建立的一種簡便、可靠的構(gòu)建TALE串聯(lián)重復(fù)序列的方法。該方法的起始材料只需要分別對應(yīng)于識別4個(gè)堿基的4個(gè)TALE基本單元模塊,采用3個(gè)常見的限制性內(nèi)切酶SpeⅠ、NheⅠ和HindⅢ,通過簡單的酶切—連接反應(yīng),即可像搭建積木那樣串聯(lián)組裝出任意長度、任意順序的TALE重復(fù)序列。本方法最大的優(yōu)勢在于原理簡單、可操作性強(qiáng),不需要任何特殊的試劑或儀器,只要掌握了常規(guī)的分子克隆操作技術(shù),就可以用本方法組裝出用戶指定的TALE串聯(lián)重復(fù)序列。下面詳細(xì)介紹本實(shí)驗(yàn)室采用單元組裝法構(gòu)建人工TALEN表達(dá)載體并在斑馬魚中進(jìn)行基因組定點(diǎn)突變的具體實(shí)驗(yàn)流程與經(jīng)驗(yàn)。需要指出的是,用本方法構(gòu)建的TALEN同樣可以用于高效、定點(diǎn)突變其他物種或細(xì)胞的基因組。1材料表面1.1實(shí)驗(yàn)材料感受態(tài)細(xì)菌:用于構(gòu)建TALEN表達(dá)載體。性成熟的斑馬魚:用于突變斑馬魚內(nèi)源基因。建議選用實(shí)驗(yàn)室常用的近交系品種。1.2谷物和試劑1.2.1基于pcs2-1-tafk表達(dá)載體的回復(fù)突變體的構(gòu)建TALE單體質(zhì)粒系列(TALE基本單元模塊載體)(圖1):均為氨芐青霉素(Amp)抗性。共4種,分別稱為pA(NI)、pC(HD)、pG(NN)和pT(NG)。由本實(shí)驗(yàn)室在pMD18-T(TaKaRa)載體骨架的基礎(chǔ)上構(gòu)建,作為組裝TALE串聯(lián)重復(fù)序列的起始載體。TALE單體在連入pMD18-T載體時(shí)方向可正可反,并不影響TALE重復(fù)序列的構(gòu)建。在我們目前所用的4種載體中,pC、pG和pT都是從M13-47到RV-M的方向連入,而pA則是從RV-M到M13-47的方向插入。這類質(zhì)粒的代表性序列詳見補(bǔ)充材料。pCS2-0.5TALE-FokⅠ表達(dá)載體系列(簡稱pCS2-FokⅠ表達(dá)載體)(圖2):均為氨芐青霉素(Amp)抗性。需成對使用(pCS2-PEAS系列和pCS2-PERR系列配對)。由本實(shí)驗(yàn)室在pCS2載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建?？勺鳛楣羌茌d體,用于插入組裝好的TALE串聯(lián)重復(fù)序列,以便最終構(gòu)建出TALEN表達(dá)載體。該系列載體除了含有FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域的編碼序列之外,還帶有CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、SP6啟動(dòng)子、來自SV40的核定位序列(NLS)、3×FLAG標(biāo)簽(pCS2-0.5TALE-PEAS系列載體)或HA標(biāo)簽(pCS2-0.5TALE-PERR系列載體)等功能元件。此外,該載體中還預(yù)先組裝了TALE重復(fù)結(jié)構(gòu)域中3′端的最后0.5個(gè)重復(fù)單元(識別TALEN靶點(diǎn)中的最后一位堿基),因此,該系列載體包括分別識別A、C、T、G等4種末位堿基的4對(共8種)載體(表1)。這類質(zhì)粒的代表性序列詳見補(bǔ)充材料。構(gòu)建和檢測TALEN載體所需的引物見表2。1.2.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)基NEB限制性內(nèi)切酶:HindⅢ-HF、KpnⅠ、Nhee-HF、NotⅠ-HF或SacⅡ、SpeⅠ-HF。瓊脂糖、DNAmarker、1×TAE、氨芐青霉素、LB瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、2×TaqMasterMix(含染料)(康為世紀(jì),CW0682)、堿性磷酸酶(CIAP,TaKaRa,D2250)、1mol/LTris(pH8.0)、50mmol/LNaOH、70%乙醇、超純水(ddH2O,18M?)1.3設(shè)備和材料1.3.1taen活性檢測所需的儀器(1)構(gòu)建TALEN所需儀器:超凈工作臺(細(xì)菌操作用)、細(xì)菌培養(yǎng)搖床、臺式離心機(jī)、凝膠電泳儀、凝膠電泳槽、凝膠成像儀、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、漩渦振蕩器(Vortex)、NanoDrop(ND-1000Spectrophotometer)、PCR儀(2)在斑馬魚中檢測TALEN活性所需的額外儀器:顯微注射裝置、體視顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、配魚缸、臺式冷凍離心機(jī)1.3.2材料細(xì)菌培養(yǎng)皿、移液器、移液器吸頭、Eppendorf離心管、PCR管、顯微注射針。2實(shí)驗(yàn)過程2.1tale重復(fù)序列的構(gòu)建由于TALE重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)是串聯(lián)重復(fù)、首尾相接的,因此,理論上可以將重復(fù)單位中的任意兩個(gè)相鄰的氨基酸殘基作為串聯(lián)重復(fù)序列的起點(diǎn)和終點(diǎn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)組裝,最后只需要把第一個(gè)重復(fù)單位和最后一個(gè)(或0.5個(gè))重復(fù)單位的兩端補(bǔ)齊,即可構(gòu)成完整的TALE重復(fù)序列。根據(jù)這一原理,我們選擇TALE重復(fù)單位中第11位的絲氨酸殘基(Ser,S)到下一個(gè)重復(fù)單位中第10位的丙氨酸殘基(Ala,A)之間的序列作為新的重復(fù)單位(稱為“替換單元”,圖3A)進(jìn)行TALE重復(fù)序列的構(gòu)建。這樣,我們就可以利用氨基酸密碼子的簡并性,在“替換單元”的一端(N端)設(shè)計(jì)一個(gè)SpeⅠ的酶切位點(diǎn),另一端(C端)設(shè)計(jì)其同尾酶NheⅠ的酶切位點(diǎn)。利用同尾酶可產(chǎn)生相同的粘性末端、但是連接在一起后又會喪失原有的酶切位點(diǎn)的特點(diǎn),通過反復(fù)的酶切—連接反應(yīng),就可以將所需要的重復(fù)單元依次組裝到一起(圖3B)。最后,將TALE重復(fù)序列跟FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域的編碼序列整碼(In-frame)連接,即可構(gòu)建出完整的TALEN編碼序列及表達(dá)載體(圖3C)。更多關(guān)于構(gòu)建、應(yīng)用和檢測TALEN的各種方法的信息可參考本期另文發(fā)表的綜述“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)”和由本驗(yàn)室建立的人工核酸內(nèi)切酶(Engineeredendonuclease,EEN)的綜合數(shù)據(jù)庫與知識庫網(wǎng)站EENdb(/)。2.2選擇和確認(rèn)scope目標(biāo)點(diǎn)2.2.1tale蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)用TALEN技術(shù)的首要步驟是選擇并確認(rèn)基因組的靶位點(diǎn)。由于TALEN中的FokⅠ核酸酶結(jié)構(gòu)域通常以二聚體的形式起作用,因此,TALEN結(jié)合位點(diǎn)(或稱TALE結(jié)合位點(diǎn))也需要成對選擇。這樣,一個(gè)完整的TALEN靶位點(diǎn)(或簡稱靶點(diǎn))就包含一個(gè)左側(cè)TALE結(jié)合位點(diǎn)及其0位的t堿基和一個(gè)右側(cè)TALE結(jié)合位點(diǎn)及其0位的t堿基,以及它們之間的間隔序列(Spacer)。其中,左、右兩側(cè)的TALEN單側(cè)靶點(diǎn)(即TALEN結(jié)合位點(diǎn))也可稱為“半位點(diǎn)”(Half-site)。除非有特別說明,本文下面提到的TALEN靶點(diǎn)均指由左、右兩個(gè)TALE結(jié)合位點(diǎn)(半位點(diǎn))及其兩側(cè)0位的t堿基加上中間的Spacer所構(gòu)成的完整的靶序列(圖4)。TALE/TALEN單側(cè)靶點(diǎn)(即半位點(diǎn))及其0位的t堿基的結(jié)構(gòu)通式為:5′-t(N)nN-3′。應(yīng)用本方法構(gòu)建TALEN表達(dá)載體建議遵從如下原則選擇靶點(diǎn)(圖4):(1)半位點(diǎn)的方向:TALE蛋白自N端到C端識別并結(jié)合DNA單鏈的方向是從5′端到3′端(圖4)。為了便于FokⅠ結(jié)構(gòu)域形成二聚體,TALEN靶點(diǎn)中左、右兩側(cè)半位點(diǎn)的單鏈方向必須是相反的,即一個(gè)半位點(diǎn)設(shè)計(jì)在正義鏈上,另一個(gè)半位點(diǎn)則需設(shè)計(jì)在反義鏈上。(2)半位點(diǎn)的長度:單側(cè)靶點(diǎn)(半位點(diǎn))最好控制在11~16bp(即n=11~16;這里并不包括0位的t),這樣即能保證靶向的特異性,也不需要太多的構(gòu)建步驟。合成識別大于16bp靶點(diǎn)的TALE重復(fù)序列和相應(yīng)的TALEN需要增加酶切—連接的步驟,花費(fèi)額外的時(shí)間和精力;如確有必要也可以選擇。(3)0位堿基(需要特別指出的是,這個(gè)0位的t并不需要組裝對應(yīng)的TALE單元模塊):緊鄰單側(cè)靶點(diǎn)(半位點(diǎn))5′端上游的第一個(gè)堿基(稱為第0位的堿基)必須為t(圖3、圖4)。(4)末位堿基:單側(cè)靶點(diǎn)3′端的最后一個(gè)堿基(對應(yīng)于TALE中的最后0.5個(gè)重復(fù)單位)盡量選擇T(因?yàn)樘烊淮嬖诘腡ALE家族蛋白的靶序列中末位為T的占大多數(shù))(圖4)。(5)Spacer的選擇:本方法采用的TALE重復(fù)序列與FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域之間相連接的氨基酸殘基數(shù)為63,因此,Spacer的堿基數(shù)最好控制在12~21bp。同時(shí),如果計(jì)劃用酶切的方法檢測TALEN的活性與效率,還需要在Spacer中找到一個(gè)單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),并且盡量讓這個(gè)酶切位點(diǎn)位于Spacer的中間位置。(6)靶點(diǎn)預(yù)測工具:可以通過Bogdanove實(shí)驗(yàn)室提供的TALEN靶點(diǎn)預(yù)測網(wǎng)站(/)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測,也可以先通過NEB公司的網(wǎng)站(/NEBcutter2/index.php)找到酶切位點(diǎn),再在酶切位點(diǎn)的兩側(cè)人工尋找TALE結(jié)合位點(diǎn)。選擇TALEN靶點(diǎn)時(shí)需要考慮的其他問題可參考本文后面的“3常見問題和注意事項(xiàng)”。2.2.2taen打靶實(shí)驗(yàn)由于TALEN的序列特異性較高,靶序列中只要有一個(gè)堿基出現(xiàn)錯(cuò)配(Mismatch)就有可能較大幅度地降低TALEN的活性。因此,選定靶點(diǎn)后,強(qiáng)烈建議實(shí)測一下每個(gè)實(shí)驗(yàn)室自己養(yǎng)殖的實(shí)驗(yàn)材料(例如斑馬魚、果蠅等動(dòng)植物個(gè)體或體外培養(yǎng)細(xì)胞)的實(shí)際序列,根據(jù)實(shí)測序列調(diào)整靶點(diǎn)的序列,并且最好用同一批(測序確認(rèn)正確,并且靶序列是純合的)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行TALEN打靶實(shí)驗(yàn),以避免SNP的影響。(1)確認(rèn)靶點(diǎn)在基因組中的唯一性:在Ensembl網(wǎng)站上分別用單側(cè)靶點(diǎn)序列進(jìn)行Blast比對,確認(rèn)該序列在所選用的物種的基因組中是單一位點(diǎn)。否則建議重新選擇靶點(diǎn)。(2)PCR擴(kuò)增靶點(diǎn)序列:從準(zhǔn)備打靶的實(shí)驗(yàn)材料中PCR擴(kuò)增靶點(diǎn)及附近的序列。引物距離靶點(diǎn)最好大于100bp,PCR產(chǎn)物最好不要超過500bp,并且擴(kuò)增后為單一條帶。(3)測序確認(rèn)靶點(diǎn)序列:PCR產(chǎn)物直接送去測序(不要經(jīng)過TA克隆),根據(jù)實(shí)測序列調(diào)整或重新選擇靶點(diǎn)。注意應(yīng)選擇測序結(jié)果顯示為單一序列的實(shí)驗(yàn)材料(動(dòng)植物個(gè)體或細(xì)胞株)確認(rèn)靶點(diǎn),不要選擇含有SNP或其他變異的雜合子。(4)檢測酶切位點(diǎn)的效率:如果計(jì)劃采用酶切的方法檢測TALEN活性,則需要對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切驗(yàn)證。要求盡量酶切完全,并且電泳后能明顯與原條帶區(qū)分開。(5)遴選實(shí)驗(yàn)材料:根據(jù)后續(xù)打靶實(shí)驗(yàn)的需要,采用上述的PCR與測序策略篩選出足夠量的靶點(diǎn)正確且為純合的實(shí)驗(yàn)材料(動(dòng)植物個(gè)體或細(xì)胞株)。2.3talen配置2.3.1tale重復(fù)序列的構(gòu)建按示例的格式填寫經(jīng)前述步驟確認(rèn)過的TALEN靶點(diǎn)信息,并設(shè)計(jì)構(gòu)建方案。(2)根據(jù)構(gòu)建方案選擇兩個(gè)相鄰的TALE重復(fù)載體,分別進(jìn)行雙酶切與電泳、切膠回收(示例3,圖3B)。用NheⅠ和HindⅢ雙酶切處于TALE重復(fù)序列N端(對應(yīng)識別5′端靶序列)的TALE質(zhì)粒,回收得到TALE骨架片段(N端TALE,包含TALE元件和載體骨架;需回收的長度為2.7kb的骨架+m×102bp的TALE元件);用SpeⅠ和HindⅢ雙酶切處于TALE重復(fù)序列C端(對應(yīng)識別3′端靶序列)的TALE質(zhì)粒,回收得到TALE元件片段(C端TALE,僅包含TALE元件;需回收的長度為(m×102+16)bp的片段)。此處,m代表載體中所含的TALE重復(fù)單元數(shù)。注意:(1)也可以采用其他的酶切組合構(gòu)建同樣的TALE重復(fù)載體。例如,可以采用G+TTA的組合構(gòu)建GTTA載體。不過,TALE單載體經(jīng)SpeⅠ和HindⅢ雙酶切后得到的TALE單體片段只有100多bp,如果小片段DNA回收的得率不高,會影響到后續(xù)的連接。因此,最好不要采用C端為單載體的組合(例如,最好不要采用GTT+A的組合)。(2)剩余的膠回收產(chǎn)物可標(biāo)注清楚后保存于-20℃,以便用于構(gòu)建其他位點(diǎn)。(3)連接、轉(zhuǎn)化,涂氨芐青霉素平板(Amp抗性),37℃培養(yǎng)12h。(4)挑取單克隆菌落,液體培養(yǎng)基培養(yǎng),用M13-47和RV-M引物對進(jìn)行菌液PCR鑒定。注意:PCR的延伸時(shí)間要根據(jù)載體中TALE重復(fù)單元的數(shù)目(m)進(jìn)行調(diào)整(表3):一個(gè)TALE單元有102bp,而引物還會在質(zhì)粒骨架上額外擴(kuò)增168bp,這樣,PCR產(chǎn)物的總長度就是(102×m+168)bp。(5)電泳檢測,將PCR鑒定正確(預(yù)期產(chǎn)物長度參見表3)的剩余菌液擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒,即完成了本輪組裝,得到了本輪所需的TALE重復(fù)序列中間載體。注意:經(jīng)菌液PCR鑒定正確的質(zhì)?？梢宰鳛橹虚g載體存放在-20℃冰箱,以備構(gòu)建其他位點(diǎn)時(shí)使用。(6)重復(fù)步驟(2)至(5),延長TALE串聯(lián)重復(fù)序列,直至達(dá)到所需的順序與數(shù)目(圖5)。所得到的載體稱為pMD-TALE(圖5)?！臼纠?】從單載體開始,通過4輪酶切—連接構(gòu)建tnikb左側(cè)半位點(diǎn)TALE重復(fù)序列(圖5)(除最后0.5個(gè)重復(fù)單元之外)的步驟:注意:由于TALE中的最后0.5個(gè)重復(fù)單元已經(jīng)預(yù)先構(gòu)建到pCS2-FokI系列載體中,因此,每一個(gè)TALEN單側(cè)靶位點(diǎn)中3′端的最后一個(gè)堿基(對應(yīng)于最后0.5個(gè)重復(fù)單元)不在上述構(gòu)建范圍之內(nèi)!例如,上例中的tnikb左側(cè)半位點(diǎn)的序列應(yīng)為15個(gè)堿基:5′-GTTATTTTATCCCCT-3′,在這一步驟中,只需要組裝對應(yīng)于前14個(gè)堿基5′-GTTATTTTATCCCC-3′的TALE重復(fù)單元即可。(7)TALE串聯(lián)重復(fù)序列pMD-TALE構(gòu)建完畢后,挑單克隆做PCR、電泳檢測,選取大小正確的克隆送測序檢驗(yàn)(用通用測序引物M13-47和RV-M雙向測序)。注意:由于TALE重復(fù)序列較長且重復(fù)性很強(qiáng),需要選擇一個(gè)技術(shù)較好、質(zhì)量有保證的測序公司,才能保證將雙向的TALE序列拼接完整。2.3.2tale重復(fù)序列片段的回收和鑒定為了提高FokⅠ的酶切活性、TALEN靶向的特異性,本方法采用了只能以異二聚體的形式起作用的兩種Sharkeyform的FokⅠ變體(PEAS和PERR)配對使用。此外,pCS2-FokI載體的選用還同時(shí)取決于半位點(diǎn)中3′端的最后一個(gè)堿基。(8)根據(jù)兩個(gè)TALEN半位點(diǎn)最后一位堿基的性質(zhì)選用合適的pCS2-PEAS和pCS2-PERR載體對,用NheⅠ分別單酶切,電泳、切膠回收(5.5kb)。例如:對于tnikb的左側(cè)半位點(diǎn),由于其最后一位堿基為T,因此應(yīng)選用pCS2-T-PEAS或pCS2-T-PERR。(9)CIAP去磷酸化,快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒回收后備用。(10)用SpeⅠ和NheⅠ雙酶切“2.3.1”中第(7)步組裝好的TALE重復(fù)序列載體pMD-TALE,電泳后切膠回收備用?；厥?n×102)bp大小的條帶(n表示pMD-TALE載體中的TALE重復(fù)單元數(shù)),得到TALE重復(fù)序列片段。(11)將上述去磷酸化的pCS2載體骨架與雙酶切后回收的TALE重復(fù)序列片段連接、轉(zhuǎn)化,涂氨芐青霉素平板,37℃培養(yǎng)12h。(12)菌液PCR鑒定TALE重復(fù)序列片段的連入方向:根據(jù)“2.3.1”中第(7)步組裝出來的TALE重復(fù)序列中的最后一個(gè)完整重復(fù)單元(3′端)的性質(zhì)選用上游引物(A-For、T-For、C-For或G(NN)-For)。如果這個(gè)重復(fù)單元跟FokⅠ載體上預(yù)設(shè)的0.5個(gè)重復(fù)單元的RVD相同,則需要向前(5′端方向)尋找一個(gè)與該RVD不同的序列作為引物。例如:對于tnikb的左側(cè)半位點(diǎn),由于其最后一位堿基為T,而最后一個(gè)完整重復(fù)單元識別的是C,因此應(yīng)選C-For作為上游引物。下游引物63dn位于pCS2-FokⅠ的骨架上。不同位置的上游引物,PCR延伸的時(shí)間不同,PCR產(chǎn)物的長度也不同。例如,上游引物對應(yīng)最后一個(gè)完整的TALE單元時(shí)預(yù)期應(yīng)擴(kuò)增出~350bp的條帶;而每向5′端方向位移一個(gè)TALE重復(fù)單元,PCR產(chǎn)物就會增加102bp。如果TALE重復(fù)序列連入的方向正確,就能擴(kuò)增出條帶,否則無法擴(kuò)增出條帶?？蓳?jù)此鑒定連入方向正確的菌落。同時(shí)用SP6通用引物測序確認(rèn)。(13)酶切檢測TALE重復(fù)序列片段的連入情況:利用pCS2-TALEN載體上的KpnⅠ和NheⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)對pCS2-TALEN載體進(jìn)行雙酶切鑒定,可以檢測在上一步的酶切—連接反應(yīng)中是否發(fā)生了TALE重復(fù)序列的串連或斷連,同時(shí)也可以用來鑒定TALE重復(fù)序列連入pCS2-FokⅠ載體的方向(圖6)。pCS2-TALEN質(zhì)粒骨架大小約為5kb,TALE重復(fù)序列的大小為(n×102+443)bp。2.4taen活性檢測與斑點(diǎn)魚突變體篩選2.4.1表面活性劑的選擇和pcr的擴(kuò)增這一步首先通過體外轉(zhuǎn)錄合成編碼TALEN的mRNA,再將成對的mRNA顯微注射到斑馬魚單細(xì)胞受精卵中,2~4d后提取基因組DNA,采用限制性內(nèi)切酶酶切法檢測TALEN位點(diǎn)是否發(fā)生突變,同時(shí)可以估算TALEN的突變效率。這一步也可以選用直接克隆測序等其他方法代替酶切檢測。(14)線性化TALEN表達(dá)載體:通過NotⅠ或SacⅡ酶切線性化鑒定正確的pCS2-TALEN載體對(需要先確認(rèn)一下NotⅠ或SacⅡ?yàn)閱我幻盖形稽c(diǎn))。線性化完全后可直接用快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒回收。(15)體外轉(zhuǎn)錄TALENmRNA(SP6,Ambion)、回收,溶于20~30μLDEPCH2O中,Nanodrop定量。(16)將左、右兩側(cè)半位點(diǎn)的一對TALENmRNA混和,顯微注射到單細(xì)胞期斑馬魚受精卵中,得到F0胚胎(注射量建議:50~150pg/半位點(diǎn))。同時(shí)留一些未注射的同批胚胎作為對照。(17)取2~4dpf注射后表型正常的胚胎,1~5個(gè)胚胎為一組,提取基因組DNA,PCR擴(kuò)增靶點(diǎn)周圍的序列(最好用“2.2.2”中鑒定過的引物)。(18)酶切檢測TALEN在靶點(diǎn)造成的突變。如果有完整的、未切開的PCR條帶(前提是未注射的對照胚胎的PCR產(chǎn)物能夠全部被切開),則說明靶點(diǎn)可能發(fā)生了突變。將未切開的條帶切膠回收,連入T載體,測序鑒定靶點(diǎn)的突變情況(圖8)。未切開的PCR條帶占所有條帶的熒光亮度的百分比可大致反映TALEN的突變效率。2.4.2taen突變株的篩選和活性鑒定這一步首先是檢測F0(Founder)外交得到的F1胚胎,以便篩選出生殖細(xì)胞中帶有(可遺傳的)靶位點(diǎn)突變的F0成魚。將這樣的F0成魚外交得到的后代(F1)養(yǎng)大,再通過剪尾逐條檢測F1的靶位點(diǎn)序列,即可篩選出攜帶可遺傳TALEN突變的斑馬魚個(gè)體。(19)將TALEN活性>1%(最好能>10%,這樣更便于篩選)、存活率較高(不低于70%)的同批F0胚胎飼養(yǎng)至性成熟(一般電泳結(jié)果中肉眼可見未切開的條帶即可認(rèn)為TALEN活性>1%)。(20)與野生型(WT)成魚外交,收集F1胚胎。每條F0建議檢測20個(gè)以上的F1胚胎。3解決問題和注意事項(xiàng)3.1基因編碼算法(1)靶位點(diǎn)選擇因基因而異,一般而言,靶點(diǎn)靠前比較好,盡量在基因編碼序列(CDS)的前2/3,但是要在ATG之后,這樣突變等位基因(Allele)可編碼的多肽產(chǎn)物較短,更接近無效突變(Nullmutation)。同時(shí)還要考慮避免在第一個(gè)起始密碼子的下游還存在額外的具有相同閱讀框(in-frame)的起始密碼子。(2)靶點(diǎn)也可選擇在內(nèi)含子和外顯子的交界處,以破壞靶基因的剪接。(3)還要注意靶基因是否有多個(gè)不同的剪接變體或轉(zhuǎn)錄變體,注意需要突變的是某一個(gè)剪接變體或轉(zhuǎn)錄變體,還是所有的剪接變體或轉(zhuǎn)錄變體。3.2taen的特異性關(guān)于TALEN的脫靶(Off-target)效應(yīng),目前的研究并不多。從僅有的幾篇報(bào)道來看,TALEN的特異性很高,脫靶效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于ZFN?？赏ㄟ^前述的TALEN靶點(diǎn)預(yù)測網(wǎng)站(/TALENT/)預(yù)測特定基因組中潛在的脫靶位點(diǎn),然后通過深度測序檢測TALEN的脫靶效應(yīng)。3.3基于tale的小序單元(1)TALE重復(fù)序列組裝過程中是以pMD18-T載體作為骨架。該載體骨架僅用于承載TALE重復(fù)序列,并不用來表達(dá)TALEN蛋白,因此,TALE重復(fù)序列的插入方向并不影響其進(jìn)行酶切—連接的組裝。如果用該載體骨架上的通用引物對TALE重復(fù)序列(包括起始載體和中間載體)進(jìn)行測序驗(yàn)證,則只要測序結(jié)果正確即可,無論所得到的序列跟預(yù)期序列等同還是反向互補(bǔ),均可用于后續(xù)的組裝步驟。(2)為了盡量降低序列的重復(fù)性,本實(shí)驗(yàn)室采用的TALE重復(fù)單元中除了RVD之外,某些其它位點(diǎn)(例如第四位的氨基酸殘基)的序列也有可能存在一些差異(例如第四位的氨基酸殘基有可能為A、D或E),但是并不影響使用(圖10)。(3)本方法(“單元組裝法”)在載體構(gòu)建上有一個(gè)獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):載體構(gòu)建過程中每一輪產(chǎn)生的中間載體(甚至酶切、回收的產(chǎn)物)都可以保留下來,用于其他TALEN的構(gòu)建。這樣一方面可以避免重復(fù)構(gòu)建中間載體,另一方面可以節(jié)省時(shí)間和精力,提高構(gòu)建效率。TALEN載體構(gòu)建得越多,中間載體就會積累得越多,這樣新TALEN的構(gòu)建效率也會越來越高。例如,如果預(yù)先構(gòu)建好全部16個(gè)雙單元載體,就可以直接從雙單元開始構(gòu)建TALEN,而不需要從單載體開始,這樣就可以節(jié)省一輪的時(shí)間;如果除了4個(gè)單載體之外,還預(yù)先構(gòu)建好全部的雙單元(16個(gè))、三單元(64個(gè))和四單元(256個(gè))載體,那么只需要兩輪就可以構(gòu)建出16個(gè)完整的TALE重復(fù)單元,比從單載體開始可節(jié)省一半的時(shí)間。3.4nhe/tale重復(fù)序列載體的穩(wěn)定性NheⅠ、SpeⅠ和HindⅢ等內(nèi)切酶也可以選用其他公司的產(chǎn)品。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn),用NheⅠ和HindⅢ雙酶切TALE重復(fù)序列載體時(shí)有時(shí)會出現(xiàn)多余的條帶(預(yù)期應(yīng)該只有一個(gè)條帶),這有可能是NheⅠ或HindⅢ的星活性造成的。如果出現(xiàn)這種情況,建議改用NEB的HF(highfidelity)酶,同時(shí)減少質(zhì)粒的用量(例如<1μg),酶切時(shí)間也不要太長(例如控制在2h之內(nèi))。3.5taenmrna的注射量對于新構(gòu)建的TALEN對,可嘗試注射不同的劑量的mRNA,從中選取一個(gè)最佳劑量用于制備斑馬魚突變體。一般而言,mRNA的注射量越大,TALEN作用的效率就越高,不過,斑馬魚胚胎的畸形率也會隨之上升、存活率下降;每半位點(diǎn)TALENmRNA的注射劑量超過100pg后胚胎畸形率的上升會更為明顯。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn),劑量范圍可控制在50~150pg/半位點(diǎn),一般100pg左右為最佳劑量,可兼顧胚胎的存活率和TALEN的效率。在這個(gè)劑量下,斑馬魚胚胎的存活率一般可達(dá)到90%以上。4斑馬魚幼魚的人工誘導(dǎo)與親水性基因的產(chǎn)生本實(shí)驗(yàn)室在原來已發(fā)表的文章基礎(chǔ)上,增加了針對最后一位堿基(對應(yīng)最后的0.5個(gè)TALE重復(fù)單元)為A、C和G的FokⅠ載體,并構(gòu)建出了所有的三單元TALE載體(64個(gè))和四單元TALE載體(256個(gè)),這樣既擴(kuò)大了靶點(diǎn)的選擇范圍,又可以節(jié)省載體的構(gòu)建時(shí)間。目前,本實(shí)驗(yàn)室利用單元組裝法已成功構(gòu)建了100多對針對斑馬魚不同基因組位點(diǎn)的TALEN,經(jīng)內(nèi)切酶檢測,突變成功率大于70%(未發(fā)表數(shù)據(jù)),這與Cade等最近報(bào)道的結(jié)果類似。本實(shí)驗(yàn)室一半以上的TALEN位點(diǎn)的突變效率大于30%,有的甚至接近100%,這充分顯示了在斑馬魚中應(yīng)用TALEN技術(shù)的高效和簡便。其中,本實(shí)驗(yàn)室大部分未檢測到活性的TALEN靶點(diǎn)的信息可參考EENdb網(wǎng)站(/)。斑馬魚性成熟一般需要3個(gè)月的時(shí)間。如果希望