雞艾美耳球蟲套式pcr鑒別方法的建立

雞球蟲病是導(dǎo)致養(yǎng)雞業(yè)損失的主要原因之一。其危害輕則導(dǎo)致雞的生長發(fā)育受阻和生產(chǎn)性能下降,重則造成雞的大批死亡,尤其是雛雞階段,15～50日齡的雛雞發(fā)病率高,死亡率高達(dá)80%。雞對抗球蟲藥物抗藥性的不斷增強(qiáng),致使該病的危害日趨嚴(yán)重。目前,對Eimeria蟲種的鑒定主要集中在形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性及由其導(dǎo)致的病變特征等方面,而對Eimeria的分子鑒定和同源性分析研究較少。由于不同種類的Eimeria多在同一地域交叉流行,這進(jìn)一步說明了開展Eimeria分子鑒別檢測的重要性。核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)存在于高度重復(fù)的核糖體中,它的進(jìn)化速度快且序列較短,適用于分析科間、屬間及種間的遺傳關(guān)系。本研究對哈爾濱地區(qū)雞Eimeria的ITS1序列進(jìn)行鑒定,建立了套式PCR種間鑒別診斷方法,并將該序列用于同源性分析研究中,旨在為進(jìn)一步研究Eimeria的分類和流行病學(xué)奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1pcr體系建立試驗(yàn)組6種雞Eimeria:柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)HEB.Ten株、堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)HEB.ace株、早熟艾美耳球蟲(E.praecox)HEB.pra2株、和緩艾美耳球蟲(E.mitis)HEB.mit株、毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)HEB.nec1株和布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)HEB.bru株由本實(shí)驗(yàn)室分離,用于建立套式PCR體系;參考蟲株中的E.necatrixHRB.nec2株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)病理教研室提供,E.brunettiSH.bru株、E.praecoxSH.pra1和SH.pra2株、E.tenellaSH-ROUZHI株、SH-IKF株及SH-A121株DNA由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所惠贈,并由本實(shí)驗(yàn)室保存于-80℃。1.2根生化科技有限公司DNA提取試劑盒和凝膠回收試劑盒:均購自天根生化科技有限公司;ExTaq酶、dNTPs、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、pMD18-T載體:均購自大連寶生物工程有限公司。1.3引物的設(shè)計與合成分別取試驗(yàn)組單卵囊增殖純化后6株Eimeria和參考蟲株中E.necatrix的1×106個孢子化卵囊,加入500μLPBS,于玻璃研磨器內(nèi)充分研磨,12000r/min離心2min,取沉淀按DNA提取試劑盒操作說明提取基因組DNA,-20℃保存。參考GenBank中登錄的Eimeria屬下各蟲種的ITS1序列,用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計1對通用引物擴(kuò)增ITS1全長,同樣設(shè)計針對不同Eimeria蟲種的特異性套式引物(見表1),引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。試驗(yàn)組和參考蟲株共13株Eimeria的套式PCR反應(yīng)體系(50μL)包括:雙蒸水32.5μL;10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL;MgCl2(25mmol/L)4μL;dNTP(各2.5mmol/L)4μL;10μmol/L上、下游引物各1μL;5U/μLExTaq酶0.5μL;模板(通用引物PCR以保存的DNA為模板,種特異性引物PCR以通用引物PCR產(chǎn)物為模板)2μL。所有PCR擴(kuò)增條件為:95℃10min;94℃30s、退火溫度(見表1)30s,72℃30s,25個循環(huán);72℃10min。同時設(shè)不加DNA模板的陰性對照,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.4pcr擴(kuò)增條件選擇用試驗(yàn)組中6種Eimeria的通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,分別用單一的種特異性引物以同樣條件對6株Eimeria進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以鑒定引物的特異性。1.5pcr檢測dna將試驗(yàn)組中6種Eimeria卵囊按相同比例混合后提取DNA,用通用引物擴(kuò)增后,取擴(kuò)增產(chǎn)物再分別以種特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以鑒定引物的特異性。1.6mdh5感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)突變體的構(gòu)建按照膠回收試劑盒說明書純化試驗(yàn)組和參考蟲株共13株艾美耳球蟲套式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,按說明書操作連接于pMD18-T載體中,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。篩選陽性重組菌,抽提重組質(zhì)粒,進(jìn)行PCR鑒定和EcoRⅠ+HindⅢ雙酶切鑒定,同時設(shè)不加模板的陰性對照。陽性重組菌由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。1.7序列分析將試驗(yàn)組和參考蟲株13個測序蟲株的ITS1序列經(jīng)調(diào)整后導(dǎo)入DNAStar軟件中進(jìn)行序列比對分析。2結(jié)果2.1brunti的snpe序列和mcis的pcr擴(kuò)增試驗(yàn)組中6種雞艾美耳球蟲通用引物PCR擴(kuò)增結(jié)果(見圖1A)為:E.tenella和E.necatrix的ITS1序列較大,約600bp;其次是E.brunetti的ITS1序列,約550bp;E.praecoxITS1序列約為450bp;E.acervulina約為400bp;E.mitis比E.acervulina稍小,約390bp。特異性引物套式PCR擴(kuò)增結(jié)果(見圖1B)為:E.tenella、E.acervulina、E.praecox、E.mitis、E.necatrix和E.brunetti擴(kuò)增片段分別約為330、325、348、202、160和312bp。2.2引物擴(kuò)增產(chǎn)物的pcr擴(kuò)增效果利用種特異性引物分別對試驗(yàn)組6種Eimeria的通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行套式PCR特異性鑒定,結(jié)果顯示(見圖2)引物的特異性較好,除個別產(chǎn)生彌散條帶外,其他擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期片段大小相符,表明引物特異性良好。2.3套式pcr檢測將試驗(yàn)組中6株Eimeria的卵囊按相同的比例混合并提取DNA后,分別進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示(見圖3)5種Eimeria擴(kuò)增出的目的片段與預(yù)期片段大小相同,僅E.necatrix的擴(kuò)增(見泳道5)出現(xiàn)2條擴(kuò)增帶,且都不與預(yù)期片段大小相同。2.4不同種間的實(shí)行菌株his1測序結(jié)果將所有13個測序蟲株的ITS1序列經(jīng)調(diào)整后導(dǎo)入DNAStar序列分析軟件中,結(jié)果顯示同一蟲種不同株的ITS1序列的一致性較高(見表2,其中右上部分為序列的一致性,左下部分為序列的差異性)。E.praecoxHEB.pra2株與E.praecoxSH.pra1株和SH.pra2株的一致性分別為98.6%和98.8%;E.necatrixHEB.nec1株與HRB.nec2株的一致性為97.0%;E.brunetteHEB.bru株與SH.bru株的一致性為97.0%;E.tenellaHEB.Ten株與E.tenellaSH-A121株、SH-IKF株和SH-ROUZHI株的一致性均為98.5%(見表2)。由此證明雞球蟲種內(nèi)不同分離株間ITS1序列的一致性較高,僅有個別堿基的差異。而不同蟲種間的ITS1序列一致性均在25%左右,最高為33.2%,最低僅為16.9%,種間的一致性較低。因此,ITS1序列可用于雞球蟲種間區(qū)分和鑒定,亦可用于雞球蟲種內(nèi)不同分離株的區(qū)分和鑒定。3整株種間鑒別和系統(tǒng)發(fā)育分析雞球蟲蟲種之間沒有交叉免疫原性,同一宿主可感染數(shù)種球蟲,而且不同地理區(qū)域球蟲種類的分布和致病力差異亦有所不同。所以,了解一個地域雞球蟲種類及流行情況,對于球蟲病的防治具有重要的指導(dǎo)意義,而對球蟲種類的鑒定更將成為調(diào)查的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的球蟲分類和鑒定主要依賴于生物學(xué)和形態(tài)學(xué)方法。然而,僅依靠形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特征對雞球蟲進(jìn)行種類鑒定往往不夠準(zhǔn)確,結(jié)合分子生物學(xué)方法對其遺傳標(biāo)記位點(diǎn)的研究能實(shí)現(xiàn)球蟲的種間鑒別分類和系統(tǒng)進(jìn)化分析。球蟲核糖體DNA中介于18S和28S之間的ITS序列具有高度的保守性和進(jìn)化的時鐘性,被有效用于球蟲種間鑒別診斷和系統(tǒng)進(jìn)化研究中。本研究以ITS1序列為靶位點(diǎn),設(shè)計Eimeria種間通用引物和特異性引物,針對在哈爾濱分離的6株Eimeria建立了套式PCR種間鑒別診斷方法。在混合卵囊PCR特異性檢測試驗(yàn)中,E.necatrix的特異性引物出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。這說明本試驗(yàn)設(shè)計的E.necatrix的特異性引物僅適