氧化偶氮甲烷葡聚糖硫酸鈉小鼠模型在慢性腸道炎癥中的研究進展

癌癥是人類死亡的主要原因之一，大約1.4例癌癥的病因和發(fā)病機制與感染和慢性炎癥有關(guān)。炎癥性腸病(inflammatoryboweldisease,IBD)是一類病因和發(fā)病機制未明的腸道炎癥性疾病,根據(jù)其病理特征可分為潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis,UC)和克羅恩病(Crohn’sdisease,CD),年發(fā)病率分別為1/10萬和1.2/10萬,且呈逐年上升和年輕化趨勢。IBD患者發(fā)生結(jié)直腸癌(colorectalcancer,CRC)的風(fēng)險率增高,8~10年后以每年0.5%~1%遞增,30年后高達18%的IBD患者可能發(fā)展為CRC。盡管IBD相關(guān)的CRC僅占全部結(jié)直腸癌的1%~2%,它卻是導(dǎo)致IBD患者死亡的常見原因。氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸鈉(dextransodiumsulfate,DSS)誘發(fā)的結(jié)腸炎相關(guān)性癌癥(colitisassociatedcancer,CAC)動物模型由于成功地模擬IBD誘發(fā)CRC的全過程,被廣泛用于研究IBD相關(guān)性CRC的癌變機理,闡明其病理變化與癌變原理有助于發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌治療新的候選靶點。本文簡要綜述AOM/DSS模型與炎癥相關(guān)性癌癥癌變機理的研究進展。1ds-aom/dss檢測大鼠腸道黏膜皮質(zhì)的生長炎癥向癌癥的轉(zhuǎn)變是一個復(fù)雜、多步驟的過程。慢性炎癥的持續(xù)刺激是多種腫瘤產(chǎn)生的關(guān)鍵原因。通常UC臨床表現(xiàn)為持續(xù)的復(fù)發(fā)、緩解的復(fù)雜病程,伴隨周期性結(jié)腸黏膜潰瘍、黏膜壞死和再生等病理學(xué)改變,這種重復(fù)損傷與修復(fù)的病程增加了黏膜上皮發(fā)展為CRC的風(fēng)險。利用化學(xué)致癌劑AOM與致炎劑DSS的協(xié)同作用,模擬腸道黏膜上皮持續(xù)的損傷與修復(fù)病程發(fā)展了AOM/DSS實驗動物模型,即首先用AOM誘導(dǎo)癌變,然后使實驗小鼠持續(xù)暴露在DSS的炎性刺激環(huán)境下,在短期可建立伴隨潰瘍性結(jié)腸炎的癌變模型。AOM/DSS模型致癌方法簡單、成瘤率高、周期短,成為常用的腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌動物模型之一。1.1預(yù)處理dsAOM是化學(xué)致癌劑1,2-二甲基肼(1,2-dimethylhydrazine,DMH)代謝中間產(chǎn)物,兩者均屬于間接致癌劑,本身并不致癌,需經(jīng)體內(nèi)代謝激活轉(zhuǎn)化為甲基氧化偶氮甲醇(methylazomethanol,MAM)才能發(fā)揮致癌作用。DMH或AOM經(jīng)血液進入肝臟,在肝臟中DMH首先經(jīng)N-氧化反應(yīng)生成AOM,然后AOM經(jīng)肝乙醇誘導(dǎo)型細胞色素p450亞型(CYP2E1)催化發(fā)生羥基化反應(yīng)生成活性代謝物MAM,隨后MAM與葡萄糖醛酸和(或)硫酸鹽或谷胱甘肽結(jié)合,通過膽汁或血液系統(tǒng)進入腸道,在腸道中被腸道菌群水解酶分解為游離化合物,后經(jīng)結(jié)腸組織酶或細菌和結(jié)腸組織激活系統(tǒng)作用,MAM自發(fā)分解為甲基碳正離子從而使DNA烷基化,包括在DNA鳥嘌呤O6或N7位上添加甲基形成O6-甲基-脫氧鳥苷和N7-甲基-脫氧鳥苷(圖1)。研究表明,AOM引起鳥嘌呤O6甲基化是誘導(dǎo)突變損傷最主要的原因。另外,MAM上乙醇功能基團通過肝外組織脫氫酶進一步被氧化為乙醛和乙酸后自發(fā)形成碳正離子,使MAM具有直接和間接的雙重致癌作用。AOM具有致癌作用穩(wěn)定、高效的特點,被越來越多的研究選擇作為化學(xué)致癌劑來誘導(dǎo)實驗動物的結(jié)腸癌。化學(xué)致炎劑DSS是一種人工合成的硫酸鹽多糖,小鼠經(jīng)飼喂含有DSS的飲水可以形成炎癥性腸病模型(簡稱DSS模型)。其病理改變接近人類UC,往往出現(xiàn)以血便、腸道黏膜潰瘍和粒細胞浸潤為特征的結(jié)腸炎癥。DSS不僅可以引起小鼠急性UC,經(jīng)過多個循環(huán)飼喂也可以誘發(fā)慢性UC和一定比率的CRC。DSS的致炎機制尚未闡明,可能與DSS的負電荷影響DNA合成、抑制上皮細胞增生、破壞腸黏膜屏障、導(dǎo)致巨噬細胞功能障礙及腸道菌群失調(diào)有關(guān)。腸道菌群失調(diào)可能與小鼠急性炎癥有關(guān),而T細胞介導(dǎo)的免疫紊亂可能與慢性腸道病理損傷有關(guān)。DSS的促癌作用機制并不清楚,研究表明慢性或反復(fù)腸黏膜炎癥通過多種機制包括誘導(dǎo)基因突變,促進隱窩細胞增生,改變隱窩細胞代謝,改變膽汁酸腸肝循環(huán)和破壞菌群生長平衡等,導(dǎo)致腫瘤形成。DSS致腸黏膜損傷部位所浸潤的肥大細胞或巨噬細胞產(chǎn)生的超氧負離子可促進腫瘤生長。1.2u3000不同給藥劑量和不同模型對直結(jié)腸腺癌的影響1996年,Okayasu等給予雌性CBA/J小鼠單劑量AOM腹腔注射(7.5mg/kg),2周后給予3個循環(huán)DSS處理(以含3%DSS飲水飼喂7d,然后轉(zhuǎn)正常飲水14d為1個循環(huán))。第11周觀察到實驗組小鼠出現(xiàn)結(jié)直腸腫瘤,而對照組小鼠未見腫瘤形成,在實驗動物上首次驗證了反復(fù)黏膜壞死和再生對腫瘤形成的促進作用。較單純使用AOM或DSS處理實驗動物誘導(dǎo)腫瘤的實驗周期大為縮短。此后,該方法得到逐步優(yōu)化。如給Crj:CD-1(ICR)小鼠腹腔注射單劑量AOM(10mg/kg),1周后給予2%DSS飲水飼喂7d。第12周可見部分小鼠有高分化腺癌從肛門脫垂,第20周觀察到所有小鼠都發(fā)生直結(jié)腸腺癌,腫瘤生成率大為提高。Neufert等建立AOM/DSS模型制備的標(biāo)準(zhǔn)方案:單次小劑量AOM(10mg/kg)腹腔注射聯(lián)合3個循環(huán)DSS飼喂(2.5%DSS7d+正常飲水14d為1個循環(huán)),實驗周期縮短可至9周。AOM/DSS模型誘導(dǎo)方法主要有兩種:“四步法”為AOM單劑量(7.5~12.5mg/kg)腹腔注射后,即時或1周后飼喂含1%~3%DSS飲水7d(也有4d),之后改為正常飲水14d為1個循環(huán),共循環(huán)3次;“兩步法”與前者的區(qū)別在于將3次循環(huán)的DSS處理縮短為單次循環(huán),共兩步完成(圖2)。四步法較兩步法加速了腫瘤的生長。在誘導(dǎo)AOM/DSS模型過程中,根據(jù)所用實驗小鼠品系和AOM或DSS給藥劑量不同,實驗動物出現(xiàn)CAC的情況各異。近交系小鼠A/J和SWR/J敏感性高,經(jīng)AOM反復(fù)腹腔注射后,最早可于第6周觀察到腫瘤形成。AKR/J小鼠則對AOM耐藥而不產(chǎn)生腫瘤;致炎劑DSS的促癌作用具有劑量依賴性,采用AOM單劑量(10mg/kg)腹腔注射和含不同劑量DSS飲水飼喂7d的方法處理雄性ICR小鼠后,成瘤率隨DSS劑量的增加而提高。飼喂DSS濃度大于1%促進小鼠腫瘤形成,飼喂0.1%或0.25%DSS的小鼠則不產(chǎn)生腫瘤,且飼喂高劑量DSS飲水可引起小鼠嚴(yán)重的腸道炎癥和硝基化應(yīng)激反應(yīng);不同遺傳背景小鼠對AOM/DSS誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的敏感性不同。采用單劑量AOM(10mg/kg)腹腔注射和含1%DSS飲水4d的方法分別處理雄性Balb/c、C3H/HeN、C57BL/6N和DBA/2N等不同近交系小鼠后,第18周觀察發(fā)現(xiàn)C57BL/6N和Balb/c小鼠結(jié)腸腺癌發(fā)生率分別為50%和100%,C3H/HeN和DBA/2N小鼠則沒有腺癌發(fā)生,僅有少數(shù)腺瘤形成。1.3小鼠癌前病變1925年,Crohn和Rosenberg報道了首例由于炎性腸病引起的結(jié)直腸癌,此后人們發(fā)現(xiàn)病程超過8~10年的潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生CAC的幾率增高。IBD患者結(jié)腸黏膜的單一不典型性增生是癌前病變的表現(xiàn)。IBD相關(guān)性CAC是從“正常→低度不典型增生→高度不典型增生→腺癌”順序演變而來的。采用腹腔注射AOM(10mg/kg)和飼喂2%DSS飲水處理雄性ICR小鼠后,可觀察到炎癥導(dǎo)致腫瘤形成不同時期的病理學(xué)改變。第3周有2/5的小鼠出現(xiàn)結(jié)腸管狀腺瘤,第4周有2/5小鼠發(fā)生腺癌。此后,隨著時間推移,腫瘤發(fā)生率逐漸增加,第6周100%小鼠發(fā)生腺癌。所有時間點都可觀察到結(jié)腸不典型性增生。AOM/DSS模型通過結(jié)腸黏膜的炎癥和不典型性增生使腸黏膜受損,促進腫瘤產(chǎn)生,伴有K-Ras和β-catenin基因突變、錯配修復(fù)基因缺失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性改變。2ade模型的研究由于人體組織樣本特別是癌前病變組織樣本取材困難,AOM/DSS模型可以高效和可重復(fù)性地模擬人類炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程,該模型被廣泛用于IBD尤其是UC相關(guān)性CRC的癌變機理研究和藥物治療療效評價。檢索近年P(guān)ubMed數(shù)據(jù)庫運用AOM/DSS模型的研究工作,文章數(shù)量呈現(xiàn)逐年上升趨勢(圖3)。慢性炎癥在腫瘤的發(fā)生中占有十分重要的位置,全球約1/4腫瘤的病因?qū)W與慢性炎癥相關(guān),因慢性炎癥相關(guān)腫瘤的年死亡人數(shù)約為腫瘤總死亡人數(shù)的15%~20%。研究發(fā)現(xiàn),癌前病變的微環(huán)境中伴有大量炎性細胞、炎性因子及趨化因子的浸潤,其浸潤程度與腫瘤惡性程度相關(guān)。趨化因子及其受體是某些癌基因(如RAS/RET/Myc)激活的直接靶點。另一方面,應(yīng)用非甾體類抗炎藥(non-steroidalanti-inflammatorydrugs,NSAIDs),如環(huán)氧化酶(cycloxygenase,COX)抑制劑、塞來昔布(celecoxib)和阿司匹林可以降低某些腫瘤的發(fā)生和死亡率。2.1腸黏膜和諧性核因子(nuclearfactor,NF)-κB是炎癥相關(guān)癌癥的啟動因子,該信號激活的主要生物學(xué)效應(yīng)是使細胞存活、生長,抑制細胞凋亡。NF-κB信號通路由腸上皮和炎性細胞共同參與。在結(jié)腸炎組織中NF-κB信號通路活性增高,炎癥細胞(如巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性細胞、肥大細胞和淋巴細胞等)浸潤并釋放促炎因子,如腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)。腸上皮產(chǎn)生的TNF-α經(jīng)炎性細胞處理后發(fā)揮促癌效應(yīng),腸上皮內(nèi)NF-κB通過抑制凋亡起到促癌作用,炎性細胞內(nèi)NF-κB通過調(diào)節(jié)細胞因子來控制腫瘤生長。炎癥刺激導(dǎo)致慢性感染,炎性細胞浸潤并釋放TNF-α,活化的TNF-α與腸上皮TNF受體結(jié)合,通過IKK途徑激活NF-κB信號通路。被激活的IκB激酶β(IκBkinaseβ,IKKβ)磷酸化IκBα,并通過泛素-蛋白酶體途徑降解,從而釋放并活化NF-κB,NF-κB二聚體轉(zhuǎn)入細胞核,激活靶基因的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致許多抑制凋亡基因如Bcl-xL,促增殖基因如cyclinD1激活和TNF-α釋放等(圖4)。當(dāng)TNF-α從腸上皮細胞釋放出來,可通過旁分泌效應(yīng)引起更多炎癥細胞產(chǎn)生,并通過自分泌途徑激活NF-κB信號通路引起細胞增殖,最后發(fā)展成腫瘤。AOM/DSS小鼠腸黏膜中TNF-α表達顯著升高,可能通過激活腸上皮細胞NK-κB而促進腫瘤的發(fā)生?？筎NF-α單克隆抗體可有效抑制AOM/DSS小鼠CAC形成;IKKβ對NF-κB的活化起決定性的作用,當(dāng)IKKβ失活時,導(dǎo)致大量腸上皮細胞出現(xiàn)凋亡,AOM/DSS模型小鼠CRC成瘤率降低75%以上;NF-κB在炎癥和眾多腫瘤中被激活,是炎癥相關(guān)癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因子。NF-κB涉及細胞黏附,免疫調(diào)節(jié),促炎反應(yīng),細胞生長、分化與凋亡等重要生物學(xué)功能。腸黏膜上皮通過NF-κB激活下游靶基因,影響腸黏膜炎癥和修復(fù)過程。持續(xù)NF-κB激活會導(dǎo)致腸上皮細胞過度增生,產(chǎn)生活性氧和活性氮,損傷DNA而加速癌變進程。抑制NF-κB的活化促使凋亡前體蛋白Bax和Bak大量表達,同時降低抑制凋亡蛋白Bcl-xL。2.2il-6-gp130-stat3信號通路NF-κB-IL-6-STAT3級聯(lián)反應(yīng)是一條促進腫瘤細胞存活和增生的重要信號通路。白細胞介素6(interleukin6,IL-6)是由NF-κB調(diào)節(jié)的一個重要的多功能細胞因子,同時作用于腸上皮及免疫細胞,從而促進腸上皮異型增生和免疫細胞釋放炎癥介質(zhì)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。IL-6與其受體sIL-6R結(jié)合形成復(fù)合物,進一步與膜糖蛋白130(glycoprotein130,gp130)相互作用,促使gp130轉(zhuǎn)化為二聚體并激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signaltransducersandactivatorsoftranscription,STAT3)信號通路(圖4)。IL-6-gp130-STAT3信號通路在AOM/DSS模型炎癥相關(guān)癌癥形成中發(fā)揮重要作用。AOM/DSS模型經(jīng)基因重組修飾實驗證明IL-6是CAC形成早期主要的啟動子,具有促增生和抗凋亡功能。IL-6在CAC發(fā)展晚期能夠促進腫瘤細胞增生,阻斷IL-6信號通路能夠延緩腫瘤細胞的增生速度。gp130介導(dǎo)腸上皮中STAT3激活,通過細胞周期G1和G2/M期影響細胞存活。STAT3的活化與否決定IL-6的致癌作用,腸上皮細胞中STAT3失活可抑制CAC的發(fā)生發(fā)展。阿司匹林可通過下調(diào)該信號通路而促進細胞凋亡,從而起到抑制CAC的治療作用。2.3tlr4信號通路對cac造成的影響Toll樣受體(Toll-likereceptors,TLRs)介導(dǎo)的髓樣分化因子88(myelioddifferentiationfactor88,MyD88)依賴性NF-κB信號通路在傳遞炎癥信號和增強炎癥反應(yīng)中具有重要作用。TLRs如TLR4識別配體后,可傳遞給細胞內(nèi)的接頭蛋白MyD88,進而招募下游信號分子,最終活化炎癥的調(diào)節(jié)因子NF-κB等。NF-κB進入細胞核內(nèi),與特定的啟動子結(jié)合,從而調(diào)控炎癥相關(guān)基因的表達,激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答(圖4)。目前認(rèn)為TLRs功能也與腫瘤形成相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),TLR4在CAC患者和AOM/DSS模型小鼠腸道組織中過表達,而TLR4基因缺失則會顯著減少結(jié)腸癌變。TLR4誘導(dǎo)COX-2和前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)表達與表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)信號增強有關(guān),表明TLR4促進慢性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生。該結(jié)論進一步在基因修飾的可持續(xù)表達TLR4的AOM/DSS小鼠模型上得到驗證。同時發(fā)現(xiàn)PGE2是TLR4信號通路重要的下游分子。通過調(diào)節(jié)TLR4信號通路,維生素D可預(yù)防CAC形成。相反,TLR2具有防止結(jié)腸炎發(fā)展為CAC的功能。其機制可能與抑制IL-6-STAT3通路激活、下調(diào)Th17免疫反應(yīng)以及減少腫瘤細胞浸潤相關(guān)。2.4不同的caspase-1和質(zhì)酸Nod樣受體(Nod-likereceptors,NLRs)主要識別宿主細胞質(zhì)中的病原相關(guān)分子模式(pathogenassociatedmolecularpatterns,PAMPs),NLRs識別病原生物成分后,某些NLRs會形成胞漿的多蛋白復(fù)合體即炎性體(inflammasome),通過Caspase-1激活各種細胞因子,啟動一系列防御反應(yīng)。DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎中,腸上皮細胞炎性體如NLRP3被激活,隨后介導(dǎo)分泌IL-18促進腸上皮細胞增殖和組織再生,限制了黏膜損害,防止黏膜固有層免疫細胞的激活。而慢性DSS接觸可能導(dǎo)致腸免疫細胞中炎性體激活,引起炎性細胞因子過度生成以及組織損壞。研究發(fā)現(xiàn),NLRP3炎性體負調(diào)控CAC的發(fā)生,缺失NLRP3、ASC或Caspase-1的小鼠經(jīng)AOM/DSS處理后相對野生型小鼠更易患CAC。NLRC4-/-或Casp1–/–小鼠經(jīng)AOM/DSS處理后,CAC的發(fā)生率明顯增高。而Caspase-1對腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)作用并非與炎癥相關(guān),而是與其對腸道內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)有關(guān)。AOM/DSS刺激下,Casp1–/–小鼠的腸道內(nèi)皮細胞在腫瘤發(fā)生早期增殖明顯;至腫瘤形成后,腸道內(nèi)皮細胞的凋亡減少。2.5小鼠cac形成的天然免疫作用研究發(fā)現(xiàn),AOM/DSS模型上炎癥結(jié)腸黏膜固有層出現(xiàn)少量肥大細胞,而在腫瘤及其周圍組織中可見大量肥大細胞聚集,而且按照腺瘤、微小腺癌和腺癌的順序,肥大細胞浸潤的數(shù)量呈階梯式增加。T-bet-/-和RAG2-/-基因修飾的Balb/c小鼠經(jīng)AOM/DSS處理后,觀察發(fā)現(xiàn)小鼠腸黏膜固有層和黏膜下層出現(xiàn)中性粒細胞、巨噬細胞、CD4+淋巴細胞以及DEC205+樹突狀細胞浸潤。樹突狀細胞中T-bet表達缺失促使T-bet-/-;RAG2-/-小鼠發(fā)生CAC。天然免疫在機體抗感染免疫早期發(fā)揮主要作用,執(zhí)行天然免疫作用的細胞主要包括單核吞噬細胞、樹突細胞、自然殺傷細胞、自然殺傷T細胞、γδT細胞和B1細胞。其中,恒定型自然殺傷T(invariantnaturalkillerT,iNKT)細胞是T淋巴細胞中獨特的亞群。AOM/DSS模型上觀察到iNKT細胞具有阻止小鼠炎癥相關(guān)癌癥發(fā)生的作用。AOM/DSS模型也常用于抗腫瘤藥物療效評估,在短期內(nèi)觀察其生物學(xué)效果。如COX-2抑制劑、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferatoractivatedreceptor,PPARs)配體和天然植物化合物等分別運用AOM/DSS模型進行了預(yù)防CAC形成的療效評估。流行病學(xué)調(diào)查表明,服用NSAIDs如阿司匹林或塞來昔布可以減少75%~81%結(jié)腸癌發(fā)病率,推測NSAIDs作用靶點主要為COX-1和COX-2,但COX-2在腫瘤形成中的作用尚不清楚。COX-2在AOM/DSS小鼠腫瘤組織中表達增強,但COX-2基因敲除小鼠COX-2-/-與野生型小鼠相比,其腫瘤數(shù)目并無統(tǒng)計學(xué)差異,提示COX-2并非CRC形成的必要因素。3aom/dss模型在平臺上的應(yīng)用實驗動物模型是生命科學(xué)研究的重要工具。理想的IBD相關(guān)性CRC動物模型應(yīng)具備背景清楚,發(fā)病年齡較輕,生命周期滿足實驗需求,對造模方式敏感,較高的近端結(jié)腸癌變率,具有“炎癥→異型增生→癌變”組織學(xué)上順序改變特征,同時存在K-Ras、β-catenin、p53和APC基因突變分子事件等特征。