rhbmp2殼聚糖支架材料體外釋放動(dòng)力學(xué)研究

骨形態(tài)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)（bmp）是已知的最有效的促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)的因素。雖然bmp在局部很難維持有效的骨濃度，并且持續(xù)時(shí)間非常有限。實(shí)際研究中需要尋找合適的載體材料與其復(fù)合,起到對(duì)BMP緩釋及提供細(xì)胞生長(zhǎng)支架的作用。殼聚糖(Chitosan)為天然高分子材料,由于其價(jià)廉易得,無毒無氣味,有良好的生物特性和可降解性,在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。有鑒于此,在制作殼聚糖支架材料的基礎(chǔ)上,將殼聚糖與BMP復(fù)合,延緩BMP的釋放,探討殼聚糖作為BMP緩釋載體的可行性。1材料和方法1.1儀器、色譜和儀器殼聚糖(武漢大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院杜予民教授惠贈(zèng),分子質(zhì)量230kU,脫乙酰度92%);rhBMP-2(購自深圳達(dá)科為公司);冷凍干燥系統(tǒng)(77520-01FreeZoneb,美國Labconco公司);掃描電鏡(S-570,日本日立公司);高效液相色譜分析儀(BiologicDuroflow,美國Bio-Rad公司);色譜柱(Catalog125-0551,美國Bio-Rad公司);甲醇(批號(hào)200410019,中國上海振興化工廠);圖像分析儀(HPIAS-1000,中國千屏)。1.2-化學(xué)法乳化、干燥采用乳液冷凍干燥法。取殼聚糖0.1g,將1μgrhBMP-2溶于5ml的體積分?jǐn)?shù)1%醋酸水溶液中,然后將它們混合,用超聲勻漿機(jī)乳化均勻,放入-81℃深低溫冰箱中冷凍12h,再立即移入冷凍干燥機(jī)中在-50℃下真空干燥24h,置干燥器中備用。單純殼聚糖樣品的制作方法同上,上述樣品各20件,分別隨機(jī)抽取3件實(shí)驗(yàn)樣品和3件對(duì)照樣品作為待測(cè)樣品。1.2.21.3國外緩沖區(qū)系統(tǒng)的構(gòu)建和檢測(cè)1.3.1外部緩解模型的構(gòu)建將待測(cè)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品分別浸入磷酸鹽緩沖液,置于37℃恒溫水浴箱中,按不同的時(shí)間點(diǎn)分別留取浸出液,即為相應(yīng)時(shí)間的緩釋液。1.3.2待測(cè)緩液的制備將樣品分別放入裝有5ml0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)的器皿中,將器皿置于37℃恒溫水浴箱內(nèi)持續(xù)浸泡24h,然后暫時(shí)取出樣品,將浸出液搖勻后吸取到送檢試管內(nèi),即為緩釋第1天的待測(cè)緩釋液。原器皿用相同的PBS液反復(fù)沖洗3次,待用。將已取出的6個(gè)樣品再放入已洗凈的器皿內(nèi),再分別加入PBS液5ml,按以上相同方法浸泡、取樣。分別留取緩釋第1,2,3,4,7,14,20,30天的待測(cè)緩釋液,標(biāo)記、送檢。1.3.3甲醇水、固定相采用高效液相色譜分析儀檢測(cè),流動(dòng)相和固定相滿足如下要求:①其中流動(dòng)相:甲醇∶水=80∶20;②固定相:Rp-318柱子(250mm×4.6mm,5μm),調(diào)節(jié)流速為1.0ml/min;進(jìn)樣量50μl,保留時(shí)間3.19min,在280nm波長(zhǎng)下檢測(cè)rhBMP-2的色譜圖。1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定將rhBMP-2標(biāo)準(zhǔn)品用0.1mol/L的PBS液分別配制出濃度為0.005,0.01,0.05,0.1,0.2μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)參照液,用高效液相色譜分析儀測(cè)出不同濃度標(biāo)準(zhǔn)色譜圖,系統(tǒng)自動(dòng)測(cè)出峰高和峰面積,標(biāo)準(zhǔn)圖形的峰高和峰面積對(duì)應(yīng)rhBMP-2的量和濃度,以此為標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3.5rhbmp-2含量測(cè)定將待測(cè)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組標(biāo)記的緩釋液分別用高效液相色譜分析儀測(cè)出色譜圖,將色譜圖的峰高和峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照,計(jì)算出各個(gè)時(shí)間點(diǎn)浸出液中rhBMP-2的含量和濃度。6個(gè)樣品的各個(gè)時(shí)間的浸出液rhBMP-2含量分別與前一時(shí)間的rhBMP-2緩釋總量相加,取平均值,為該時(shí)間的rhBMP-2緩釋總量。1.3.6rhbmp-2緩沖系統(tǒng)的繪制分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品在各個(gè)時(shí)間的rhBMP-2緩釋總量的平均值,繪制rhBMP-2緩釋曲線。分析rhBMP-2緩釋曲線,歸納緩釋規(guī)律。2結(jié)果2.1各孔間的連接掃描電鏡顯示:材料表面呈多孔狀,孔的形態(tài)為圓形或橢圓形喇叭口樣,孔徑約50-200μm,孔隙率約68%,各孔之間有良好的連接(見圖1);材料斷面呈疏松海綿狀,空隙率約87%,各空隙均有較多的連接,具有不規(guī)則通空結(jié)構(gòu)(見圖2)。2.2含量和濃度檢測(cè)通過色譜圖檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)浸出液中rhBMP-2的含量和濃度見表1。由表1顯示:第1天浸出液中rhBMP-2的量為0.3317μg(33.2%),表現(xiàn)為“爆發(fā)性”釋放,以后各時(shí)間點(diǎn)為緩慢持續(xù)釋放。2.3第1天為爆發(fā)性釋放由圖3顯示其緩釋規(guī)律:rhBMP-2從支架材料中釋放的動(dòng)力學(xué)過程為第1天表現(xiàn)為“爆發(fā)性”釋放(33.2%);第2-7天rhBMP-2出現(xiàn)快速釋放;第8-14天釋放速度減慢;第15-30天出現(xiàn)緩慢而持久的釋放,至1個(gè)月釋放量達(dá)81.3%。2.4對(duì)照組的結(jié)果各時(shí)間點(diǎn)浸出液中未檢測(cè)出rhBMP-2。3討論3.1殼聚糖多孔支架的制備殼聚糖是甲殼素(Chitin)脫乙?；蟮漠a(chǎn)物,后者廣泛存在于昆蟲和海洋無脊椎動(dòng)物的外骨骼上。殼聚糖來源廣泛、取材方便,近年來殼聚糖在組織工程中的應(yīng)用日益受到重視。殼聚糖在體內(nèi)能被溶菌酶水解,降解速率與去乙?；潭瘸守?fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中殼聚糖脫乙酰度為92%,屬較高去乙?；?其降解過程需幾個(gè)月之久,為生長(zhǎng)因子與載體的體外活性實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)活性表達(dá)奠定基礎(chǔ)。它的溶解性與pH值密切相關(guān),不同的pH值下可將殼聚糖制成需要的形狀和強(qiáng)度,如凝膠、膜、微球、三維多孔支架。該實(shí)驗(yàn)制備殼聚糖多孔支架就利用其多孔三維特性,為復(fù)合生長(zhǎng)因子及生長(zhǎng)因子的緩釋提供了空間。本實(shí)驗(yàn)采用冷凍干燥法制備殼聚糖多孔支架,與Li等制備殼聚糖多孔支架有相似處。在冷凍過程中冰晶從溶液中成核并線性生長(zhǎng),冷凍干燥時(shí)冰晶相升華形成多孔結(jié)構(gòu),而多孔結(jié)構(gòu)可用于蛋白質(zhì)的釋放,使rhBMP-2在殼聚糖多孔支架中得到緩釋。支架的空隙率取決于溶液的濃度,平均孔徑由冷凍速率以及冰晶的尺寸控制,空隙的取向則與冷凍時(shí)熱梯度的幾何特性相關(guān)。如何在材料制備過程中控制材料的孔徑大小和空隙率,使蛋白質(zhì)的緩釋達(dá)到更理想的效果,有待進(jìn)一步的研究和探討。3.2rhbmp-2在殼聚糖支架材料中的釋放本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,rhBMP-2從殼聚糖支架材料中的釋放可分為3個(gè)階段:24h左右為爆發(fā)性釋放,釋放量為33%左右;第1-7天rhBMP-2呈現(xiàn)快速的釋放;第7天以后釋放速度減慢,呈緩慢持續(xù)釋放至1個(gè)月左右甚至更長(zhǎng)。爆發(fā)性釋放現(xiàn)象可能是由于制備緩釋支架材料過程中有一部分沉積在支架材料表面的蛋白質(zhì)在溶液中擴(kuò)散出來,而表現(xiàn)為rhBMP-2的快速釋放。隨著材料的降解反應(yīng)及材料的吸水膨脹,蛋白質(zhì)分子從材料微孔或降解的材料表面擴(kuò)散出來,表現(xiàn)為緩慢持續(xù)穩(wěn)定的釋放,這可能是蛋白質(zhì)的濃度差逐漸變小而導(dǎo)致釋放減慢。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,rhBMP-2從殼聚糖支架材料中至1個(gè)月時(shí)釋放約81%左右,完全釋放尚需更長(zhǎng)的時(shí)間,這為新生骨組織的生長(zhǎng)提供時(shí)間,其釋放的曲線與Whang等的報(bào)告有些一致。有研究報(bào)道在第7-14天rhBMP-2釋放非常緩慢,處于一個(gè)相對(duì)的平臺(tái)期,本實(shí)驗(yàn)尚未發(fā)現(xiàn)此釋放規(guī)律。rhBMP-2緩慢而持久的釋放行為與載體的特性有關(guān),載體材料的孔徑大小、孔隙率、疏松程度以及材料的重結(jié)晶、降解均影響著rhBMP-2的釋放。而且本實(shí)驗(yàn)中的磷酸鹽緩沖液是固定的、非生物性和非代謝性的,體內(nèi)組織液是