野生杜鵑雜交胚初代培養(yǎng)基及萌發(fā)特性研究

中國現(xiàn)有的杜鵑品種主要通過芽品種選擇，很少通過雜交育種獲得。利用當(dāng)?shù)刭Y源和繁殖對中國杜鵑花品種的發(fā)展極為重要。杜鵑遠緣雜交同時存在受精前、后障礙,受精后障礙主要表現(xiàn)為胚珠停止發(fā)育,種子不能發(fā)芽和后代白化苗等情況。受精后障礙的克服,可通過未成熟種子的培養(yǎng)來進行胚拯救,提高種子的萌發(fā)率及成苗率。URESHINO等以Anderson為基本培養(yǎng)基對常綠杜鵑和日本落葉黃花杜鵑的雜交胚進行了胚拯救。Anderson、WPM等培養(yǎng)基在杜鵑雜交胚拯救中也有所應(yīng)用。但針對杜鵑不同雜交組合,最適培養(yǎng)基類型的研究還鮮見報道,尤其是國內(nèi)有關(guān)杜鵑雜交胚的組培技術(shù)還未見報道。僅劉燕等以1/4MS為基本培養(yǎng)基,對大白花杜鵑(R.decorum)的種子胚進行了組培配方的探討。不同雜交組合由于母株營養(yǎng)狀況、雜交親和性等的差異,雜交胚的發(fā)育存在顯著不同,確立胚拯救的適宜時期顯得尤為重要。EECKHAUT等在自交授粉4~5月后進行了雜交胚的組織培養(yǎng),但個別雜交組合的種子在授粉1.5~2月后就被采收、組培。不同的杜鵑雜交組合最佳拯救的胚齡不同,不同基因型間的萌發(fā)率也有差異。MICHISHITA等認(rèn)為雜交授粉4個月后,是杜鵑雜交胚拯救的適宜時期,但他們也發(fā)現(xiàn)不同胚齡、不同基因型的雜交胚的萌發(fā)率存在顯著差異。因此本研究針對杜鵑雜交胚的敗育現(xiàn)象,以杜鵑若干雜交組合的雜交胚為試驗材料,比較了基本培養(yǎng)基類型及胚齡、基因型等對雜交胚萌發(fā)狀況的影響,對我國野生杜鵑雜交胚的初代培養(yǎng)進行了初步探討,以期提高我國杜鵑雜交胚的萌發(fā)率,促進杜鵑雜交育種進程。1材料和方法1.1細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染2011年4月杜鵑花期,以南京地區(qū)栽培的映山紅(R.simsii)和錦繡杜鵑(R.pulchrum)為母本,自交的同時,與采自昆明植物園的映山紅(R.simsii)、白花杜鵑(R.mucronatum)、窄葉杜鵑(R.araiophyllum)和薄皮杜鵑(R.taronense)雜交,如表1所列,共配置8個雜交組合,進行雜交授粉。授粉3個月后采集蒴果,用75%乙醇消毒30s,無菌水沖洗3遍,再用10%NaClO消毒15min,無菌水沖洗5遍后剝胚,接入到MS,1/4MS,WPM,改良的Anderson4種不同培養(yǎng)基中進行組培,基中蔗糖50mg/LGA3,30g/L蔗糖,8g/L瓊脂,pH值5.0。光照12h/d,光照強度1600lx,溫度250.5℃。培養(yǎng)40d后統(tǒng)計萌發(fā)率,并轉(zhuǎn)瓶1次,均轉(zhuǎn)接到各自的原基本培養(yǎng)基中(污染的除去,不計入總數(shù));培養(yǎng)40d后再次統(tǒng)計萌發(fā)率。1.2培養(yǎng)基的萌發(fā)率表2所列不同的雜交組合,在雜交授粉3個月后(部分雜交組合在授粉2,3,4個月后),收集雜交蒴果,按照1.1的滅菌方法進行滅菌,剝胚,以WPM為基本培養(yǎng)基(添加50mg/LGA3+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂)進行培養(yǎng),中間沒有轉(zhuǎn)瓶,通過添加滅菌的WPM+30g/L蔗糖的培養(yǎng)液來補充營養(yǎng)。培養(yǎng)條件如1.1相同。培養(yǎng)30,60d后統(tǒng)計萌發(fā)率,3個月胚齡的雜交胚在最終培養(yǎng)120d后,統(tǒng)計萌發(fā)率,出苗率和出愈率,而4個月胚齡的雜交胚最后一次統(tǒng)計是在最終培養(yǎng)90d后?；蛐吞接懼械淖罱K數(shù)據(jù)是在培養(yǎng)120d后統(tǒng)計的。萌發(fā)率=(萌發(fā)成苗+形成愈傷)的個數(shù)/接入的總雜交胚數(shù)×100%;出苗率=萌發(fā)成苗的個數(shù)/接入的總雜交胚數(shù)×100%;出愈率=形成愈傷的個數(shù)/接入的總雜交胚數(shù)×100%。2結(jié)果與分析2.1不同培養(yǎng)基中雜交胚萌發(fā)率的比較包括錦繡杜鵑自交在內(nèi),錦繡杜鵑為母本的3個雜交組合的雜交胚在培養(yǎng)40d后,雜交胚都已部分萌發(fā),并且隨著培養(yǎng)時間的延長,萌發(fā)率也在提高(表1)。在這3個雜交組合中,自交胚的萌發(fā)率較低。而映山紅為母本的5個雜交組合中,映山紅×窄葉杜鵑的雜交胚完全沒有萌發(fā),映山紅×薄皮杜鵑的雜交胚在培養(yǎng)80d后,僅在MS培養(yǎng)基上有極少量萌發(fā)(2.9%),映山紅自交胚的萌發(fā)率也比較低,但映山紅與異地種源父本的雜交胚萌發(fā)速度較快,萌發(fā)率也最高。映山紅×白花杜鵑的雜交胚雖然萌發(fā)速度較慢,但培養(yǎng)80d后雜交胚的萌發(fā)率達到35%~55%。以上結(jié)果表明,不同雜交組合雜交胚之間的萌發(fā)率有很大差異。同一雜交組合在不同培養(yǎng)基中的萌發(fā)率顯著不同,錦繡杜鵑×映山紅的雜交胚在MS,1/4MS培養(yǎng)基中的萌發(fā)率最高,達55%以上,在WPM培養(yǎng)基中萌發(fā)率也有45%;錦繡杜鵑自交、錦繡杜鵑×白花杜鵑、映山紅×白花杜鵑的雜交胚在WPM培養(yǎng)基中的萌發(fā)率較好;映山紅異地種源雜交胚在4種培養(yǎng)基中的萌發(fā)率都比較高,其中在WPM與MS培養(yǎng)基中的萌發(fā)速度快,萌發(fā)率也比較高,尤其是在MS培養(yǎng)基中;映山紅自交胚在WPM,MS及1/4MS培養(yǎng)基中萌發(fā)率高于改良Anderson培養(yǎng)基,但在WPM培養(yǎng)基中的萌發(fā)速度快,萌發(fā)率也比較高。綜合以上數(shù)據(jù)可以看出,大多數(shù)雜交組合的雜交胚在WPM培養(yǎng)基中萌發(fā)較好,且整體生長狀態(tài)較好(圖1,培養(yǎng)80d后所拍照片),其次是在MS培養(yǎng)中,適宜的組合數(shù)僅次于WPM培養(yǎng)基。因此以下實驗都以WPM為基本培養(yǎng)基。2.2不同基因型的雜交胚萌發(fā)情況以映山紅A為母本的12個雜交組合中,有4個雜交組合的雜交胚萌發(fā),萌發(fā)率差異顯著,映山紅×馬纓花雜交胚的萌發(fā)率最高,其次是映山紅自交胚,映山紅×腺果杜鵑和映山紅×基毛杜鵑較低,其中映山紅×基毛杜鵑的雜交胚的萌發(fā)率僅有0.7%(表2);以映山紅B為母本的11個雜交組合中,有9個雜交組合的雜交胚萌發(fā),僅映山紅×云錦杜鵑、映山紅×大白花杜鵑1這2個雜交組合的雜交胚未萌發(fā),其中自交胚的萌發(fā)率最高;以映山紅C為母本的3個雜交組合中,有2個雜交組合的雜交胚萌發(fā)。由此可以看出不同基因型的雜交胚,組培后萌發(fā)力存在顯著差異。同時結(jié)果也顯示以映山紅B為母本的雜交組合,其雜交胚的萌發(fā)率整體偏高。映山紅A和映山紅B與浙江云錦雜交胚的萌發(fā)率為0和56.7%;映山紅A和映山紅B與薄皮杜鵑雜交胚的萌發(fā)率為0和68.8%;映山紅A和映山紅B與睫毛杜鵑雜交胚的萌發(fā)率為0和34.8%;映山紅A和映山紅C與碟花杜鵑雜交胚的萌發(fā)率為0和39.5%;映山紅A和映山紅C與基毛杜鵑雜交胚的萌發(fā)率為0.7%和18.2%。由此可以看出,不同植株的母本與同一父本花粉雜交后,雜交胚的萌發(fā)率也存在顯著差異。映山紅B與云錦杜鵑(浙江)和云錦杜鵑(云南)雜交胚的萌發(fā)率分別為56.7%和0,來源于不同地方的同一種父本與同一個母株雜交,幼胚之間的萌發(fā)率也有差異。馬銀花A和B母本僅與露珠杜鵑和紅花錦繡杜鵑的雜交胚僅有2.0%和2.1%的萌發(fā)率,因此,馬銀花杜鵑和其他基因型雜交的胚拯救還是比較困難的。各雜交組合的雜交胚萌發(fā)后都部分形成愈傷,部分長成幼苗,不同雜交組合,愈傷與幼苗所占的比例都有所不同。2.3遺傳因素對混合胚胎發(fā)芽的影響2.3.1兩個雜交胚的萌發(fā)率部分雜交組合,如映山紅×美容杜鵑等在2個月胚齡時進行了培養(yǎng),但均沒有萌發(fā)(數(shù)據(jù)未顯示)。多數(shù)組合,如映山紅A×滇南杜鵑、映山紅A×馬纓花、映山紅A×浙江云錦、映山紅A×大王杜鵑、映山紅A×薄皮杜鵑、映山紅A×滿山紅、映山紅A×睫毛杜鵑這些雜交組合3個月胚齡和4個月胚齡的雜交胚培養(yǎng)時都有萌發(fā)。對這些組合的兩個胚齡時期的萌發(fā)率進行方差分析,得到如下結(jié)果:映山紅A×馬纓花、映山紅A×浙江云錦、映山紅A×薄皮杜鵑這3個雜交組合3個月胚齡的雜交胚萌發(fā)率顯著大于4個月胚齡的雜交胚;而映山紅A×滇南杜鵑和映山紅A×睫毛杜鵑這2個雜交組合4個月胚齡的雜交胚萌發(fā)率顯著大于3月胚齡;映山紅A×大王杜鵑和映山紅A×滿山紅這兩個雜交組合在兩個胚齡時期的萌發(fā)率差異不顯著(表3)。映山紅×美容杜鵑、映山紅×大白花杜鵑、馬銀花A×滇南杜鵑、馬銀花B×白花錦繡、馬銀花B×滿山紅等雜交組合3月胚齡的雜交胚也沒有萌發(fā),4個月胚齡的雜交胚培養(yǎng)時有萌發(fā);映山紅×基毛杜鵑的雜交胚,3個月胚齡培養(yǎng)時有萌發(fā),但4月胚齡培養(yǎng)時沒有萌發(fā)。映山紅×云錦杜鵑這個雜交組合,授粉2個月、3個月、4個月后所取的雜交胚,培養(yǎng)后都沒有萌發(fā)。2.3.2錦、映射山紅a薄皮不同雜交胚的培養(yǎng)效果對3個月胚齡和4個月胚齡培養(yǎng)時都有萌發(fā)的雜交組合進行成苗途徑(形成愈傷和直接成苗)的方差分析,結(jié)果表明,映山紅A×馬纓花、映山紅A×滇南杜鵑、映山紅A×浙江云錦、映山紅A×大王杜鵑、映山紅A×睫毛杜鵑這幾種雜交組合3個月胚齡的雜交胚培養(yǎng)時,形成的愈傷比率顯著大于4個月胚齡的雜交胚,形成幼苗的比率小于4個月胚齡的雜交胚;映山紅A×薄皮杜鵑和映山紅A×滿山紅這兩個雜交組合3個月和4個月胚齡的雜交胚,培養(yǎng)后形成愈傷和幼苗的比率的差異不顯著;只有映山紅A×馬纓花這1個雜交組合3月胚齡的雜交胚出苗率顯著大于4個月胚齡的雜交胚。綜上所述,胚齡對杜鵑雜交胚的成苗途徑也有很大影響,對于大多數(shù)組合的雜交胚而言,幼齡胚更易形成愈傷,相對成熟的胚更易成苗。3雜交胚萌發(fā)規(guī)律對杜鵑雜交幼胚的拯救,WPM培養(yǎng)基是最廣適的培養(yǎng)基,大多數(shù)雜交組合的雜交胚在WPM培養(yǎng)基中萌發(fā)較好,與EECKHAU在杜鵑雜交胚的組培中選用的培養(yǎng)基一致。其次是MS培養(yǎng),適宜的組合數(shù)僅次于WPM培養(yǎng)基。URESHINO和MICHISHITA都選用的Anderson作為其杜鵑雜交胚的基本培養(yǎng)基,但在我們的試驗中除了映山紅×白花杜鵑這一雜交組合在改良的Anderson培養(yǎng)基上萌發(fā)率還比較好之外,其余雜交組合在這一培養(yǎng)基上的萌發(fā)率都不太理想。這表明不同雜交組合雜交胚的拯救,適宜的基本培養(yǎng)基類型也有所不同,但WPM培養(yǎng)基應(yīng)該是杜鵑雜交胚拯救時,優(yōu)先被選擇的培養(yǎng)基類型。胚培養(yǎng)過程中胚的發(fā)育主要有3種方式:一是繼續(xù)進行正常的胚胎發(fā)育,維持“胚性生長”;二是在培養(yǎng)后直接萌發(fā)成苗,稱之為“早熟萌發(fā)”;三是先形成愈傷組織,并由此分化形成胚狀體或芽原基?；蛐?、胚齡及激素等都會影響幼胚的成苗途徑。本研究發(fā)現(xiàn)幼齡胚易于形成愈傷,較成熟的胚發(fā)育成幼苗的比率高。RANGAN認(rèn)為植物幼胚拯救的成功率在很大程度上受基因型的影響,在親緣關(guān)系比較近的栽培品種上差異也很大。一般雜交父母本基因型差異小,親緣關(guān)系比較近的雜交組合親和性好,雜交胚培養(yǎng)容易獲得成功。本研究中同一亞屬內(nèi)的組間雜交,如映山紅A×滿山紅的雜交胚萌發(fā)率高,也進一步證實了這一點。李辛雷等在菊屬種間雜交胚拯救中,也發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系較近,有利于子房直接萌發(fā)。不同母株與同一父本花粉雜交后,雜交胚萌發(fā)率也存在顯著差異,這或許與母株的苗齡、營養(yǎng)狀況等的差異有關(guān)。不同雜交胚敗育的時間也不同,掌握不同雜交胚在胚敗育之前最適宜的接種時期,將大大提高離體胚培養(yǎng)的效率。早期的雜交胚還處在異養(yǎng)時期,還沒有達到可以萌發(fā)的水平,在外界離體培養(yǎng)時對營養(yǎng)的要求高;然而當(dāng)雜交胚具備了萌發(fā)能力但又未發(fā)育完全時,這時早熟萌發(fā)也難以獲得成功;發(fā)育后期時又會因為雜交胚的敗育而失敗。因此,確定合適的胚拯救時間也至關(guān)重要。本研究中因胚齡的不同,雜交胚的萌發(fā)力出現(xiàn)3種情況:(1)部分雜交組合,3個月胚齡的雜交胚萌發(fā),但4個月胚齡的雜交胚沒有萌發(fā),或者3個月胚齡的雜交胚萌發(fā)率高于4個月胚齡的雜交胚。這種狀況的出現(xiàn),與孫曉梅、屈云慧等人認(rèn)為的胚齡越大,胚胎離體培養(yǎng)越易成活的觀點一致。劉小寧等也推測在雜交胚發(fā)育過程中,胚乳的中途退化使得胚在發(fā)育過程中缺乏營養(yǎng),會導(dǎo)致其發(fā)育中止或敗育;同時營養(yǎng)物與生長抑制物間平衡失調(diào)也可能胚敗育。(2)個別組合,2,3,4個月胚齡的雜交胚均未萌發(fā)。其可能的原因之一:雜交胚已經(jīng)在2個月胚齡前就敗育了,一般而言,