低劑量x射線照射的小鼠胸腺細胞蛋白質(zhì)表達及生物活性研究

根據(jù)該報告，低劑量輻射對生長發(fā)育、延長動植物的壽命、提高戰(zhàn)斗力、降低劑量輻射對染色體的生成率進行了監(jiān)測。但對這種反應的機制尚未完全闡明。Anderson等認為是由于低劑量輻射使細胞周期或細胞亞群發(fā)生了改變所致,但后來多數(shù)實驗不支持這種假說;Ikushima等指出可能與DNA損傷后修復能力被低劑量輻射激活或者低劑量輻射激活某種調(diào)節(jié)系統(tǒng),使細胞產(chǎn)生某種保護性物質(zhì)而產(chǎn)生低劑量輻射興奮效應。本文擬通過低劑量X射線照射小鼠誘導胸腺細胞蛋白質(zhì)表達及其生物活性的觀察,探討低劑量輻射興奮效應的可能機制。材料和方法1動物分組實驗雄性健康昆明小白鼠,體重(20±2)g,購自吉林大學實驗動物部。隨機分為假照射組和75mGy照射組。照射后4h,斷頭處死,取胸腺制備單細胞懸液。2電壓、電流2.2m用PhilipsX射線深部治療機進行全身照射。電壓200kV,電流10mA;過濾板0.5mmCu和1.0mmAl。靶皮距212cm,劑量率12.5mGy/min。3高效液相色譜儀美國產(chǎn)ECONOSystem低壓層析儀,Spectra高效液相色譜分析儀,PAK300SW7.5mm(ID)×30cm色譜柱。1214-Rackbeta自動液閃計數(shù)儀(LKB,瑞典)。Olympus顯微鏡(日本)。4材料和試劑刀豆球蛋白A(concanavalin,ConA)購于Sigma公司,[3H]-TdR中國醫(yī)學科學院原子能研究所產(chǎn)品,RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco,美國),其它試劑均為國產(chǎn)分析純。5細胞培養(yǎng)及提取分別斷頭處死75mGy照射和假照射4h的小鼠各100只,在無菌條件下取出胸腺(以下分離提取步驟均在4℃條件下進行),置于RPMI1640培養(yǎng)液中。毛玻璃片研磨制成單細胞懸液,經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾結(jié)締組織。1000×g離心10min,棄上清,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次,將制得的照射組和假照射組單細胞懸液分別制備胸腺細胞蛋白質(zhì)提取物。6洗脫和色譜測定將制得的胸腺細胞蛋白質(zhì)提取物過0.45μm的硝酸纖維素濾膜后,分別取3mL加于1×50cm的SephadexG-100凝膠柱表面,用0.15mol/LPBS,以0.06mL/min的流速洗脫。在4℃的冰柜中,洗脫20h,每管收集120滴的洗脫物。取每管的洗脫物10μL注入HPLC色譜柱。在流動相為0.15mol/LPBS、流速1mL/min、柱壓300psi、檢測波長280nm的條件下,進行HPLC分析。7通過測定蛋白質(zhì)活性并制備染色體樣品采用本室的常規(guī)方法加以改進。8蛋白質(zhì)測定和蛋白質(zhì)分子量測定分別采用Lowry法和凝膠過濾法。結(jié)果1g-100凝膠過濾胸腺細胞粗提物經(jīng)SephadexG-100凝膠過濾后,照射組和假照射組都出現(xiàn)兩個峰,胸腺細胞第一峰兩組無明顯差別,第二峰照射組低于假照射組。2每管蛋白質(zhì)組分將胸腺細胞的粗提物,經(jīng)SephadexG-100凝膠過濾后,收集洗脫物得到12管蛋白質(zhì)組分。每管蛋白質(zhì)組分經(jīng)過HPLC分析,發(fā)現(xiàn)只有第11管蛋白質(zhì)組分照射組與假照射組比有明顯差別,表現(xiàn)為胸腺細胞24.5kD的蛋白質(zhì)照射組明顯少于假照射組(圖1)。圖1第一峰照射組略高于假照射組,但是差別不顯著(P>0.05)。3蛋白質(zhì)組分對正常小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的影響將胸腺細胞的粗提物,經(jīng)G-100凝膠過濾后的第11管蛋白質(zhì)組分加入ConA刺激的正常小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)終濃度為6.25mg/L的蛋白質(zhì)組分照射組小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化明顯低于假照射組(表1)。4染色體畸變試驗從表2可以看出,將假照射組和照射組的胸腺細胞的粗提物第11管蛋白質(zhì)組分(經(jīng)G-100凝膠過濾后所得)預先加入接受1.5GyX射線照射的人外周血淋巴細胞中,發(fā)現(xiàn)照射組染色體畸變率明顯低于假照射組。輻射誘導細胞的蛋白質(zhì)表達低劑量輻射興奮效應的機制,近幾年受到人們的關(guān)注。有許多假說,其中低劑量輻射誘導細胞產(chǎn)生某種保護性物質(zhì)是熱點之一。Wolff等學者曾報道低劑量輻射可誘導人淋巴細胞合成蛋白質(zhì),并且該蛋白質(zhì)能與DNA發(fā)生特異結(jié)合,此結(jié)合從照射后1h開始,6h達高峰。劉樹錚等曾證明50mGy-75mGyX和γ射線離體和全身照射后淋巴細胞表達一些新蛋白質(zhì),其分子量由25-247kD不等。這些蛋白質(zhì)還具有生物活性,可刺激T細胞的增殖或減輕輻射對染色體的損傷。本文進一步證明小鼠接受75mGy全身照射后4h,胸腺細胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生了變化,從照射組小鼠胸腺細胞提取的蛋白質(zhì)經(jīng)SephadexG-100凝膠過濾后,第11管終濃度為6.25mg/L的蛋白質(zhì)組分不僅具有抑制正常脾細胞增殖的作用(表1),而且能夠降低較高劑量X射線所致人外周血淋巴細胞染色體畸變的作用(表2)。將這一管的蛋白質(zhì)組分進行HPLC分析,發(fā)現(xiàn)分子量為24.5kD的蛋白質(zhì)顯著少于假照射組(圖1)。提示這種蛋白質(zhì)可能是刺激性蛋白質(zhì),由于這些蛋白質(zhì)的表達下調(diào)而使ConA刺激的正常脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化下降。另一方面,24.5kD的蛋白質(zhì)的減少,也可能激發(fā)染色體的防護機制和損傷修復程序,使較大劑量輻射所致染色體畸