桔皮中橙皮甙的分離及抑菌試驗

柑橘是我國廣泛種植的主要水果。它的皮膚可以用作中藥，具有理氣、健脾、除濕、粘液等的功效。橙皮甙是桔皮的主要活性成分之一,具有治療高血壓、血管硬化及心血管等疾病的功效。據(jù)報道,桔皮提取浸膏有較好的抗菌作用,在室溫下儲存一段時間后仍有一定的抗菌能力。目前,從生物材料中提取天然防腐劑已成為當(dāng)今世界食品添加劑的一大趨勢。為了探明桔皮提取浸膏中抑菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ),本實驗以橙皮甙為材料,對常見食品污染菌的抑菌效果進行了研究。1材料和方法1.1試劑與培養(yǎng)基細(xì)菌:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Echerichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis);酵母:漢遜氏酵母(Hansenulasp);霉菌:青霉(Penicilliumsp)、黑曲霉(Aspergillussp)。分別簡寫為S、E、B、H、P和A,以上菌種由湖北農(nóng)學(xué)院生命科學(xué)院微生物實驗室提供。牛肉膏、蛋白胨、瓊脂為生化級試劑;蔗糖(A.R級)、NaCl(A.R級)、甲醇(A.R級)、HCl(A.R級)、NaOH(A.R級)。以上試劑由湖北省化學(xué)試劑公司供貨。柱層析硅膠(粒徑0.05～0.074mm)、硅膠GF254,均為青島海洋化工有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。橙皮甙化學(xué)對照品,由中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基按文獻自制。儀器有FTIR-1730型紅外光譜儀,CJ-1680型超凈工作臺,YSQ.SG41.280型手提式壓力蒸汽滅菌鍋,HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋,YS2-H型雙目生物顯微鏡,LRH250G型光照培養(yǎng)箱,JA2003型電子天平,ZK-072型恒溫干燥箱。1.2紅外光譜表征取干桔皮粉30g,10%的氯化鈣15mL,5%的偏重亞硫酸鈉10mL,10%的氫氧化鈉15mL,飽和的氫氧化鈣600mL置容器內(nèi)。水浴加熱至50℃保溫3h,過濾后濾液用稀鹽酸調(diào)pH至6～7,冷卻放置過夜,抽濾所得的固體物反復(fù)用熱水洗至淡黃色。將固體物溶于吡啶的甲醇溶液(含吡啶1%)中,以柱層析硅膠為固定相,甲醇為洗脫液,得白色針狀晶體。測定熔點為256～258℃。經(jīng)紅外光譜儀測定(KBr壓片),其特征吸收峰為:3545cm-1(s、O-H),2945cm-1(w、C-H),1636cm-1(m,C=C),1602cm-1(s、C-O),1100cm-1、1073cm-1(s、C-O-C)。熔點及紅外表征數(shù)據(jù)與文獻值相符。將所得的產(chǎn)物溶于甲醇,以硅膠GF254為固定相,甲醇為展開劑,薄層層析只觀察到一個點,Rf值為0.87,其結(jié)果與用橙皮甙標(biāo)準(zhǔn)品做對照實驗的結(jié)果一致。1.3無菌試驗1.3.1生物指標(biāo)及培養(yǎng)條件將培養(yǎng)基制成平板,細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,酵母及霉菌用PDA培養(yǎng)基。用無菌生理鹽水把各種菌種配制成106～107個/L孢子懸液,吸取0.2mL孢子懸液均勻涂抹到滅菌平板上。將浸漬過橙皮甙溶液的濾紙圓片(φ6cm)風(fēng)干,放到每個涂有菌液的平板上,等距離放3片,每個試驗平行6次,文中所列數(shù)據(jù)為平均值。細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24h;酵母及霉菌在28℃下培養(yǎng)48h。測定抑菌圈直徑大小,并用無菌水作空白對照(以CK表示),確定抑菌效果。以上操作均在無菌條件下進行。1.3.2以數(shù)為基礎(chǔ)的社會量表用無菌甲醇將橙皮甙配制成7種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液,各溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.06%、0.08%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%。將濾紙片置于各質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液中浸泡,涼干,放入平板中,測定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)橙皮溶液的抑菌效果。1.3.3ph對牛肉膏蛋白和pda培養(yǎng)基的制備用Na2HPO4和NaH2PO4配制5個pH梯度的緩沖溶液,pH分別為5、6、7、8、9。并用各種pH緩沖溶液制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基。將濾紙片置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%橙皮甙溶液中浸泡、涼干,放入平板中,測定其抑菌效果。1.3.4抑菌效果測定將橙皮甙置80℃水浴,100℃水浴和121℃濕熱條件下,熱處理15min后,將在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%橙皮甙溶液浸泡過濾紙片,涼干后置于平板中,測定其抑菌效果。2結(jié)果與分析2.1生物指標(biāo)對甲基霉菌及漢遜氏酵母生長的影響橙皮甙對試驗的6種菌的生長均有很強的抑制作用,其中對酵母菌的抑制作用最強。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時,橙皮甙對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉及黑曲霉的生長抑制作用最強;當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%時,橙皮甙對金黃色葡萄球菌和漢遜氏酵母的生長抑制作用最強?？瞻讟訜o抑菌作用,見表1。2.2橙皮蚤對6種病原菌生長的影響除金黃色葡萄球菌、枯草桿菌及大腸桿菌在pH=5時不能生長外,在pH5～9范圍內(nèi),橙皮甙對6種菌的生長均有一定的抑制作用,見表2。2.3高溫處理對橙皮茯苓的抑菌力橙皮甙經(jīng)3種溫度處理15min后,仍具有很強的抑菌力,與未經(jīng)高溫處理的樣品對比,兩者實驗結(jié)果無明顯變化,說明高