基于bcs-rolox法的灘涂海泥水溶體系抗氧化性能研究

海泥屬于礦渣。根據(jù)現(xiàn)代研究，海污泥具有豐富的礦物、膠體成分、獨特的海洋微生物、維生素、氨基酸和抗生素等。其豐富的營養(yǎng)活性成分是一般化妝品基料所不具備的,它們具有促進皮膚新陳代謝、增強皮膚營養(yǎng)、保持皮膚彈性、延緩皮膚衰老的作用。浙江秀山灘涂海泥集東海生態(tài)環(huán)境和錢塘江沖積之精華,天然、潔凈、細膩,富含多種對人體皮膚有益的Ca,Fe,Zn,Se,Mg,Sr,Ge和VA,VE,VC及氨基酸等天然物質(zhì),灘涂海泥中含有的水藻類、水草和甲殼類等動植物殘骸,經(jīng)過多年淤積,已形成對人體皮膚有益的活性蛋白質(zhì)和多糖等有機物質(zhì)。這些特點正是海泥提取液具有抗氧化性能和美白功效的基礎(chǔ)。作者對秀山海泥水溶體系的抗氧化性能和美白功效的影響因子進行了研究,探討了海泥水溶體系具有最佳美容功效的條件,旨在為秀山海泥的精深加工利用提供理論依據(jù)。1實驗部分1.1樣品位置樣品海泥采自浙江秀山鄉(xiāng)灘涂,在灘涂的起始位置,按高、中、低潮位各取一點,合并三點的泥樣作為此位置的樣品。然后每隔200m取1次樣,共取5次,均勻混合5個樣品為待試樣品,其中水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%。1.2儀器、試劑與儀器Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchrom-2-carboxylicacid,VE的一種水溶性類似物)、L-酪氨酸、熊果苷、蘑菇酪氨酸酶,均購自Sigma公司;BCS(BathocuprionedisulfonateAcid,2,9-dimethyl-4,7-diphenyl-1,10-phenanthrolinedisulfonic),購自Fluka公司;其他均為國產(chǎn)分析純商品試劑。BCS用40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))乙醇溶液配制,Trolox用80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))乙醇溶液配制,置于4℃冰箱冷藏備用;其他無特別說明的溶液均為雙蒸水配制。DELTA320pH計,梅特勒-托利多公司;UV-2102紫外/可見分光光度計,上海尤尼柯儀器有限公司;GL-16G-Ⅱ高速臺式離心機,上海安亭科學(xué)儀器廠;DHG-9070AS新型電熱干燥箱,寧波江南儀器廠;ZHJH-1109垂直流超凈工作臺,上海智城分析儀器制造有限公司。1.32海洋污泥水溶系統(tǒng)的準(zhǔn)備1.3.1預(yù)處理法海泥→加蒸餾水?dāng)嚢?m(海泥)∶m(H2O)=1∶3,室溫,pH=7)→泥漿水過篩(800目)→離心(8000r/min,10min)→收集濕泥→干燥→粉碎過篩(800目)→海泥干粉(w(水)<5%)。1.3.2海泥水溶體系的制備取10g海泥干粉溶于一定溫度一定pH的50mL雙蒸水中(用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液或鹽酸調(diào)pH),溶解提取一定的時間后,經(jīng)攪拌、混勻、一定的轉(zhuǎn)速離心處理后取澄清液,沉淀加適量水重復(fù)處理3次,合并3次澄清液定容至250mL,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至100mL,制得海泥水溶體系,待測。該體系中的有效成分一般應(yīng)包括氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類、水溶性生物堿、胺類、鞣質(zhì)、苷類、無機鹽等。1.4抗衰老是一個重要表征作者把海泥應(yīng)用于美容護膚品的功效定位在抗衰老,而抗衰老的兩個重要表征就是抗氧化和美白。作者結(jié)合生產(chǎn)實際,確定了適合一般工廠實驗室條件的簡單、有效、快速的測評方法。1.4.1抗氧化性吸收劑的改進采用BCS-Trolox法測定樣品的總抗氧化性能,其原理是利用Cu2+被樣品中的抗氧化物質(zhì)還原為Cu+形式,新生成的Cu+能夠與bathocuproine(BC)結(jié)合生成有色絡(luò)合物,可以穩(wěn)定存在且在480nm～490nm處有最大吸收峰,根據(jù)吸光度值可以計算樣品的抗氧化性值。作者在此基礎(chǔ)上進行改進,采用BC的類似物BCS(BathocuprionedisulfonateAcid)作為Cu+的特定鰲合劑,結(jié)合生成桔黃色絡(luò)合物,在480nm處有最大吸收峰。每份樣品設(shè)置雙管同時檢測,雙管值差應(yīng)<0.5%。1.4.2苷抑制率采用酪氨酸酶體外評價法,選用熊果苷作為標(biāo)準(zhǔn)對照品,在陽性對照吸光度值為0.325的條件下測得的熊果苷抑制率為參比對照標(biāo)準(zhǔn)值。每份樣品設(shè)置雙管同時檢測,雙管值差應(yīng)<0.5%。樣品對酪氨酸酶活性的抑制強度以相對于熊果苷的抑制率表示,按以下公式計算:抑制率=[(A1-AS)/(A1-AC)]×100%式中A1,AC和AS分別為陽性對照,標(biāo)準(zhǔn)對照和樣品的吸光度值,抑制率高表明其對酶活性抑制強度高。2結(jié)果與討論2.1海泥提取液與溫度的關(guān)系分別在浸提溫度為25℃,35℃,45℃,55℃,65℃,75℃和85℃下制得海泥水溶體系,進行抗氧化及美白功效評價。測定時以樣品10mL分別取代各組標(biāo)準(zhǔn)物Trolox和熊果苷,配制和檢測方法見參考文獻,結(jié)果如圖1。由圖1可知,隨著溫度上升,海泥提取液的吸光度值也隨著增大,并在65℃條件下海泥提取液有最大的吸光度值,然后隨著溫度的繼續(xù)升高,吸光度值反而下降,并趨于平衡。這可能是由于海泥中的活性成分在65℃時溶解度最大,但是隨著溫度的升高,部分活性物質(zhì)開始分解或變異,降低或失去了其還原活性。由圖1還可知,隨著溫度上升,海泥提取液的酪氨酸酶抑制率也隨著增大,并在45℃條件下達到最大,然后隨著溫度的升高,抑制率反而下降,并趨于平衡。這可能是活性成分在45℃時溶解充分,而隨著溫度的升高,引起活性物質(zhì)的分解或變異,減弱或失去了其抑制酶的作用。2.2抗氧化及美白功效評價分別在提取時間為5min,10min,20min,30min,60min和120min下制得海泥水溶體系,進行抗氧化及美白功效評價。測定時以樣品10mL取代各組標(biāo)準(zhǔn)物,配制和檢測方法同上,結(jié)果如圖2。由圖2可知,體系在反應(yīng)20min時吸光度值和酶的抑制率均達到最大,并隨著時間的延長均呈現(xiàn)明顯下降的趨勢,在60min后趨于平緩。說明隨著提取時間的增加,海泥水溶體系的抗氧化活性降低,底物與酪氨酸酶的結(jié)合能力逐漸減弱,導(dǎo)致對酶的抑制活性下降。2.3氧化態(tài)酶的生成其基因連鎖的cuh+抗氧化功效評價方法中利用了Cu2+被樣品中的抗氧化物質(zhì)還原為Cu+這一反應(yīng),Cu2+的存在決定了水溶體系pH不能過大,所以在選擇pH梯度時必須考慮這一點。因此,分別在pH=3～9時,制備海泥水溶體系并進行功效評價,結(jié)果如圖3。由圖3可知,海泥水溶體系的吸光度值隨著pH的增加先上升、后降低、之后又上升。抗氧化體系的顯色原理是Cu+與BCS的絡(luò)合物的生成,隨著反應(yīng)體系pH的增大,Cu2+易生成Cu(OH)2沉淀,難以還原為Cu+,從而阻止了顯色絡(luò)合物的形成;當(dāng)pH進一步增加時,Cu(OH)2因轉(zhuǎn)化成[Cu(OH)4]2-而溶解,配合物可與體系中的還原物質(zhì)反應(yīng)而生成Cu+,但反應(yīng)程度低于酸性條件,因此,雖然吸光度有所回升,但明顯低于酸性條件下的吸光度。所以制備海泥水溶體系時,pH不宜過高。酪氨酸酶的作用過程為氧化態(tài)酶(Eoxy)與單酚(M)的非共價結(jié)合,單酚(M)上的羥基被親核進攻釋放出H+,生成EoxyM復(fù)合物。作為底物的酚或酚鹽進攻酶復(fù)合物,使EoxyM進行羥基化,生成EmetD復(fù)合物,并進一步分解成醌(Q)、H2O和脫氧態(tài)酶(Edeoxy),所以根據(jù)反應(yīng)動力學(xué)原理,H+的存在能促使Eoxy轉(zhuǎn)化為EoxyM,所以對酪氨酸酶的抑制作用隨著pH的增加而增加。由圖3可知,當(dāng)pH>7,抑制作用趨于平緩。2.4n7.2試驗結(jié)果在其他因素確定的條件下考察了離心轉(zhuǎn)速對抗氧化和美白功效的影響,轉(zhuǎn)速選擇為3000r/min,5000r/min,7000r/min,9000r/min,11000r/min和12000r/min,結(jié)果如圖4。由圖4可知,隨著轉(zhuǎn)速的提高吸光度值和酶的抑制率均逐漸增大,在9000r/min時功效均最強,之后隨著轉(zhuǎn)速的增加抗氧化功效逐漸下降,而對酶的抑制率無明顯的影響,因此制備海泥水溶體系時,離心轉(zhuǎn)速確定為9000r/min。2.5正交試驗結(jié)果在單因素分析的基礎(chǔ)上,固定離心轉(zhuǎn)速為9000r/min,分別選取溫度(θ/℃,A)、pH(B)、提取時間(t/min,C)作為海泥水溶體系抗氧化性能的影響因子進行考察,試驗安排及結(jié)果見表1,方差分析結(jié)果見表2。通過對正交試驗的結(jié)果分析,可以看出對海泥水溶體系抗氧化性能的影響因素主次順序為:A>C>B。由表1可以得到海泥水溶體系抗氧化性能最強的制備條件為A3B2C1,即溫度75℃,pH=5,時間10min。對結(jié)果進行方差分析,由表2可知,因素A的影響最顯著,因素B和因素C影響很小,與極差分析及實際操作結(jié)果一致。2.6海泥水溶體系美白功效配方正交試驗在單因素分析的基礎(chǔ)上,固定離心轉(zhuǎn)速為9000r/min,分別選取溫度(θ/℃,A)、pH(B)、提取時間(t/min,C)作為海泥水溶體