食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:ExaminationofBacilluscereusGB4789.14-2014發(fā)布2014-12-012015-05-01實(shí)施第一部分基礎(chǔ)知識(shí)1、概述2、生物學(xué)特性3、毒素與分型第二部分國標(biāo)1、培養(yǎng)基和試劑2、檢驗(yàn)程序3、說明www.uio.no/miljoforum/helse/farmas.shtml

分布:自然環(huán)境中廣泛分布－－污染食品，多見于米飯、甜點(diǎn)心、乳制品、蔬菜、水果、干果和肉制品、湯汁和豆芽等。

----我國下夏秋季隔夜剩米飯中毒為主。

----芽孢耐熱100度30min；繁殖溫度嗜中溫。－－當(dāng)攝入的食品每克中蠟狀芽孢桿菌的活菌數(shù)在106

/g食品以上可導(dǎo)致食物中毒暴發(fā)。

105/g食品為危險(xiǎn)食品。－－以惡心、嘔吐、腹疼、腹瀉癥狀為主要癥狀。－－中毒可散在、家庭或群體大規(guī)模暴發(fā)。因此，檢測(cè)食品中蠟狀芽孢桿菌具有重要衛(wèi)生學(xué)意義。

第一部分基礎(chǔ)知識(shí)

概述第一部分蠟狀芽孢桿菌概述1.分布廣泛：本菌在自然界分布廣泛，常存在于土壤、灰塵和污水中，植物和許多生熟食品中常見。2.主要引起中毒的食物：在美國和我國，在夏秋季以受污染的隔夜剩與（炒）米飯或淀粉類制品為主；

在歐洲大都由甜點(diǎn)、肉餅、色拉和奶、肉類食品引起；

3.

芽孢耐熱：繁本菌為嗜中溫菌，芽孢耐熱100度30min；污染的剩米飯溫?zé)岜４?，可致本菌大量繁殖?/p>

4.

毒力：當(dāng)攝入的食品每克中蠟狀芽孢桿菌的活

菌數(shù)在106

/g食品以上可導(dǎo)致食物中

毒暴發(fā)。105/g

食品為危險(xiǎn)食品。5.中毒：以惡心、嘔吐、腹疼、腹瀉癥狀為主要癥狀。中毒可散在、家庭或群體大規(guī)模暴發(fā)暴發(fā)。1）形態(tài)與染色

蠟狀芽孢桿菌為有周身鞭毛的G+需氧芽孢大桿菌。

6、生物學(xué)特性2）培養(yǎng)特性

*在普通營養(yǎng)瓊脂平板上：

生長成白蠟狀的大R形菌落。

3）生化特性（在種間和種內(nèi)型間分型用，見國標(biāo)表1和表2）

*能分解麥芽糖、蔗糖和水楊苷；*厭氧條件下發(fā)酵葡萄糖。*不分解乳糖、甘露醇、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、山梨醇和側(cè)金盞花醇；*硫化氫、尿素試驗(yàn)陰性，*卵磷脂酶試驗(yàn)陽性，能在24h內(nèi)液化明膠，

β－溶血;

7、毒素和酶

在肉湯培養(yǎng)物中產(chǎn)生:*腸毒素:引起食物中毒的主要原因*溶血毒素*蛋白質(zhì)分解酶*卵磷脂酶*青霉素酶等。第二部分GB

前言本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T4789.14-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T4789.14-2003相比，主要變化如下：

—修改了標(biāo)準(zhǔn)的中文名稱；

—增加了第二法蠟樣芽胞桿菌MPN計(jì)數(shù)法；—將選擇性分離培養(yǎng)基（MYP）培養(yǎng)條件由37℃培養(yǎng)12h～20h改為30℃±1℃培養(yǎng)24h～48h；—增加了溶菌酶試驗(yàn)；—修改了操作步驟；—增加了附錄A、附錄B1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中蠟樣芽胞桿菌（Bacilluscereus）的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于蠟樣芽胞桿菌含量較高的食品中蠟樣芽胞桿菌的計(jì)數(shù)；第二法適用于蠟樣芽胞桿菌含量較低的食品樣品中蠟樣芽胞桿菌的計(jì)數(shù)。

2設(shè)備和材料略3培養(yǎng)基和試劑3.1磷酸鹽緩沖液（PBS）：見附錄A中A.1。3.2甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂：見附錄A中A.2。3.3胰酪胨大豆多黏菌素肉湯：見附錄A中A.3。3.4營養(yǎng)瓊脂：見附錄A中A.4。3.5過氧化氫溶液：見附錄A中A.5。3.6動(dòng)力培養(yǎng)基：見附錄A中A.6。3.7硝酸鹽肉湯：見附錄A中A.7。3.8酪蛋白瓊脂：見附錄A中A.8。3.9硫酸錳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A中A.9。3.100.5%堿性復(fù)紅：見附錄A中A.10。3.11動(dòng)力培養(yǎng)基：見附錄A中A.11。3.12糖發(fā)酵管：見附錄A中A.12。3.13V-P培養(yǎng)基：見附錄A中A.13。3.14胰酪胨大豆羊血（TSSB）瓊脂：見附錄A中A.14。3.15溶菌酶營養(yǎng)肉湯：見附錄A中A.15。

3.16西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基：見附錄A中A.16。3.17明膠培養(yǎng)基：見附錄A中A.17。3培養(yǎng)基和試劑3.1磷酸鹽緩沖液（PBS）：略3.2甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂：見附錄A中A.2。選擇性鑒別培養(yǎng)基D－甘露醇：（發(fā)酵產(chǎn)酸：－）；酚紅指示范圍特點(diǎn)：pH值：黃色6.6－橙色－8.0紅色。蠟樣芽胞桿菌的菌落長成粉紅色；卵黃液含卵磷脂：（卵磷脂酶：＋）：菌落周圍環(huán)繞粉紅色的暈。多粘菌素B：抑制雜菌

3.3胰酪胨大豆多黏菌素肉湯：見附錄A中A.3：有酪蛋白酶分解酪蛋白，多黏菌素抑雜菌；3.4營養(yǎng)瓊脂：見附錄A中A.4：純培養(yǎng)，證實(shí)試驗(yàn)，

形成白蠟狀的大R形菌落3.5過氧化氫溶液：見附錄A中A.5。－－H2O2酶+；3.6動(dòng)力培養(yǎng)基：見附錄A中A.6：+；3.7硝酸鹽肉湯：見附錄A中A.7。硝酸鹽還原+、—，分型。

3.8酪蛋白瓊脂：見附錄A中A.8：有酪蛋白酶分解酪蛋白，使菌落周圍有透明圈。3.9硫酸錳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A中A.9。蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)—；3.100.5%堿性復(fù)紅：見附錄A中A.10

－－菌體內(nèi)紅色蛋白結(jié)晶：－;蘇云金芽胞桿菌：＋

3.11動(dòng)力培養(yǎng)基：見附錄A中A.11

3.12糖發(fā)酵管：見附錄A中A.12，木糖分解：—；厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖3.13V-P培養(yǎng)基：見附錄A中A.13，不定+、—，分型3.14胰酪胨大豆羊血（TSSB）瓊脂：見附錄A中A.14

β溶血+，菌落為白色毛玻璃狀；蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌呈現(xiàn)弱的溶血現(xiàn)象；多數(shù)炭疽芽胞桿菌和巨大芽胞桿菌為不溶血

/B.cereus.html

3.15溶菌酶營養(yǎng)肉湯：見附錄A中A.15.耐受生長+；巨大芽胞桿菌48h不生長。3.16西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基：見附錄A中A.16:+、—種內(nèi)分型用。

3.17明膠培養(yǎng)基：見附錄A中A.17.明膠液化＋

性狀/生化性狀動(dòng)力產(chǎn)卵磷脂酶酪蛋白酶過氧化氫酶陽性＋

β－溶血液化明膠在厭氧條件發(fā)酵葡萄糖

甘露醇和木糖發(fā)酵：－葡萄糖利用（厭氧）

++++—V-P試驗(yàn)++++—甘露醇產(chǎn)酸————+溶血（羊紅細(xì)胞）+++—/+—根狀生長——+——蛋白質(zhì)毒素晶體—+———注：+表示90%～100%的菌株陽性；-表示90%～100%的菌株陰性；+/-表示大多數(shù)的菌株陽性；-/+表示大多數(shù)的菌株表1蠟樣芽胞桿菌生化特征與其他芽胞桿菌的區(qū)別檢驗(yàn)程序4蠟樣芽胞桿菌平板計(jì)數(shù)法（第一法）4.1檢驗(yàn)程序蠟樣芽胞桿菌平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序見圖1。第一法適用于蠟樣芽胞桿菌含量較高的食品中蠟樣芽胞桿菌的計(jì)數(shù)；檢樣25g(或25mL)樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)報(bào)告10倍系列稀選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，涂布MYP瓊脂平板典型菌落計(jì)數(shù)及確定鑒定30℃±1℃24h～48h每個(gè)稀釋度以0.3mL、0.3mL、0.4mL的接種量分別移入三塊MYP瓊脂平板，共計(jì)6~9塊平板。甘露醇（－）卵黃（＋）多粘菌素培養(yǎng)基，粉紅色菌落和暈蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)過程：樣品制備——稀釋——接種——分離培養(yǎng)——純培養(yǎng)——確定鑒定包括染色鏡檢、生化鑒定種間、動(dòng)力試驗(yàn)+、甲/乙型溶血試驗(yàn)毛玻璃狀+、溶菌酶耐性試驗(yàn)+、蛋白毒素結(jié)晶試驗(yàn)+、種內(nèi)生化分型試驗(yàn)（選做）——計(jì)算——結(jié)果與報(bào)告。典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)：選擇有典型蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在20CFU～200CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。計(jì)數(shù)：1個(gè)或2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)（均）在20CFU～200CFU之間且（均）有典型菌落的，分別按照公式一和公式二計(jì)算。如下：

菌落計(jì)算公式（1）

T

=AB/Cd式中：

T—樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)；

A—某一稀釋度蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；

B—鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；

C—用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；d—稀釋因子。

菌落計(jì)算公式（2）

式中：T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)；A1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；A2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；B1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；B2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；C1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；C2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；1.1——計(jì)算系數(shù)（如果第二稀釋度蠟樣芽胞桿菌鑒定結(jié)果為0，計(jì)算系數(shù)采用1）；d——稀釋因子（第一稀釋度）。A1B1C1+A2B2C21.1dT=第二法適用于蠟樣芽胞桿菌含量較低的食品樣品中蠟樣芽胞桿菌的計(jì)數(shù)。5蠟樣芽胞桿菌MPN計(jì)數(shù)法（第二法）多一步增菌檢樣25g(或25mL)樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)報(bào)告10倍系列稀釋選取2個(gè)～3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液，各吸取1mL，分別接種于3管胰酪胨大豆多粘菌素肉湯確定鑒定30℃±1℃24h～48h接種MYP瓊脂平板30℃±1℃48h±2h查MPN表增菌每一稀釋度接種3管，每管接種1mL，計(jì)6~9管。查MPN檢索表（見附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中蠟樣芽胞桿菌的最可能數(shù)，以MPN/g（mL）表示。每管取一環(huán)培養(yǎng)物接種一塊平板，計(jì)6~9塊平板。復(fù)習(xí)思考題1、試述蠟樣芽胞桿菌的形態(tài)染色特點(diǎn)？引起食物中毒的量和主要食品？2、蠟樣芽胞桿菌在普通營養(yǎng)瓊脂平板上形成菌落的特點(diǎn)？在鮮血瓊脂平板上形成菌落的特點(diǎn)？在甘露醇－卵黃－多粘菌素(MYP)瓊脂培養(yǎng)基上形成菌落的特點(diǎn)？3、對(duì)蠟樣芽胞桿菌的檢驗(yàn)程序加以說明。4、解釋并自己舉例計(jì)算食品樣品蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)的計(jì)算公式（1）和公式（2）的結(jié)果報(bào)告

。

A1B1C1+A2B2C21.1dT=T=AB/Cd后面是03年國標(biāo)甘露醇（－）卵黃（＋）多粘菌素培養(yǎng)基，粉紅色菌落和暈純培養(yǎng)，證實(shí)試驗(yàn)白蠟狀的大R形菌落檢驗(yàn)程序（菌數(shù)測(cè)定）（分離培養(yǎng)）6、說明1）菌數(shù)測(cè)定

*樣品做成10-5～10-1的稀釋液*取各稀釋液0.1ml*接種兩個(gè)甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)瓊脂平板

(36±1)℃培養(yǎng)12—20h*選取適當(dāng)菌落數(shù)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)

--粉紅色(表示不發(fā)酵甘露醇)周圍環(huán)繞粉紅色暈的(表示產(chǎn)生卵磷脂酶)菌落*計(jì)算后*從中挑取5個(gè)此種菌菌落做證實(shí)試驗(yàn)。2)分離培養(yǎng)（－－純培養(yǎng)）

(稀釋)液檢樣－－選擇性培養(yǎng)基(MYP)上－－(36±1)℃－－12～20h，挑取可疑的蠟狀芽孢桿菌（粉紅色帶暈的）菌落接種于肉湯/營養(yǎng)瓊脂做成純培養(yǎng)，然后做證實(shí)試驗(yàn)。www.pouch-hcho.co.jp/japanese/virus23.html

3）證實(shí)試驗(yàn)

(1)形態(tài)觀察

本菌為G＋有芽胞的大桿菌。芽孢呈卵圓形，多位于菌體中央或稍偏于一端直徑不大于菌體。

(2)培養(yǎng)特性觀察

在肉湯中生長混濁，常稍有菌膜或壁環(huán)，振搖易乳化；在普通瓊脂平板上生成R形融蠟狀的菌落，不透明，表面粗糙，邊緣不齊。(3)生化性狀及生化分型

①生化性狀

動(dòng)力產(chǎn)卵磷脂酶酪蛋白酶過氧化氫酶陽性