牡丹珠心的非酶法分離技術(shù)研究

0非離析分離法植物的胚胎和胚胎中的珠心、囊和囊細(xì)胞的體積非常小。根據(jù)是否使用離析處理，可分為三種類(lèi)型：非離析分離法、離析分離法、非離析分離法和離析法。非離析分離法通常是利用解剖鏡、鑷子和解剖針等工具對(duì)胚珠內(nèi)的微小結(jié)構(gòu)進(jìn)行顯微解剖及分離,該方法用力不易控制,操作難度大,通常難以分離出具有原有形態(tài)的珠心等微小結(jié)構(gòu)。離析分離法采用化學(xué)方法對(duì)組織和細(xì)胞進(jìn)行離散處理,其中酶法分離是目前較常用的方法。利用酶法分離胚珠內(nèi)的胚囊等微小結(jié)構(gòu),方法較成熟,但酶處理僅被用于破壞細(xì)胞的壁物質(zhì),使細(xì)胞間的堅(jiān)固聯(lián)系喪失,尚不能使珠被和珠心細(xì)胞自然離散,加之酶作用的條件苛刻,耗時(shí)長(zhǎng),這使得酶法分離胚囊等微小結(jié)構(gòu)的操作仍具有一定的難度。非離析與離析結(jié)合分離法(如酶法與顯微解剖、壓片、滲透壓沖擊等方法結(jié)合使用),在分離胚珠內(nèi)的微小結(jié)構(gòu)時(shí),具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、速度快、成本低等優(yōu)勢(shì)。牡丹(Paeoniasuffruticosa)是中國(guó)的國(guó)花,其育種學(xué)研究具有重要意義,但到目前為止有關(guān)其珠心、胚囊、卵細(xì)胞等的分離及后續(xù)的人工受精等研究未見(jiàn)報(bào)道。因此,對(duì)牡丹胚珠內(nèi)的珠心進(jìn)行分離具有一定的意義。筆者曾提出一種植物花形態(tài)觀察新方法,并將其推廣到顯微操作領(lǐng)域。本研究利用該方法和筆者新近提出的整體透明技術(shù),對(duì)牡丹的胚珠結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察和了解,并對(duì)牡丹的珠心進(jìn)行了非酶法分離,所分離出的珠心等結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步應(yīng)用于胚囊和卵細(xì)胞的分離及組織培養(yǎng)研究。1材料和方法1.1試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)2009—2012年在河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室內(nèi),對(duì)牡丹胚珠進(jìn)行了珠心分離和結(jié)構(gòu)觀察試驗(yàn)。1.2牡丹花的結(jié)構(gòu)觀察2009—2010年在牡丹花期采集牡丹雌蕊,一部分直接用于牡丹胚珠的結(jié)構(gòu)觀察和珠心的分離,另一部分浸泡在50%～70%酒精溶液中,用于牡丹胚珠的結(jié)構(gòu)觀察。1.3測(cè)試方法1.3.1牡丹花珠心的分離將酒精溶液浸泡保存的牡丹胚珠用84消毒液原液(或稀釋液)浸泡至透明,透明后經(jīng)漂洗除去84消毒液等成分,然后制成水裝片,或用愛(ài)氏蘇木精染液染色,經(jīng)水洗后制片。牡丹胚珠的切片采用徒手切片方法制取,切片經(jīng)愛(ài)氏蘇木精染色和漂洗后制片。牡丹胚珠的制片使用OlympusCX31熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,觀察時(shí)采用3種方法,即透射光觀察、熒光觀察、透射光與熒光同時(shí)觀察。1.3.2牡丹珠心的分離取牡丹的1個(gè)心皮,用刀片縱向除去一部分子房壁,暴露出心皮內(nèi)的胚珠,將其放在解剖鏡下的膠塊上,在解剖鏡下用尖頭鑷子摘下1個(gè)胚珠,將胚珠粘在膠塊上,并將牡丹心皮放入帶蓋容器內(nèi)蓋好,置于陰涼處或冰箱中備用。用鑷子尖(或解剖針)將胚珠的外珠被縱向剖開(kāi),并向兩側(cè)掀開(kāi)以暴露出內(nèi)珠被,將內(nèi)珠被的外層縱向輕輕地剖開(kāi)、掀開(kāi),并除去一部分外珠被和內(nèi)珠被外層,暴露出珠被絨氈層(內(nèi)珠被的最內(nèi)層)。按照同樣的方法,將珠被絨氈層縱向剖開(kāi)、掀開(kāi),并除去一部分外層結(jié)構(gòu),便暴露出牡丹的珠心,沿暴露面兩側(cè)將珠心外的結(jié)構(gòu)逐步輕輕除去,最終可將牡丹的珠心分離出來(lái)。在分離珠心的過(guò)程中,按照上述方法,可分別獲得除去外珠被的胚珠、除去外珠被和內(nèi)珠被外層的珠心、除去內(nèi)、外珠被的珠心3種微小結(jié)構(gòu)。在分離珠心過(guò)程中,可使用凹玻片的凹槽或用鑷子尖在膠塊上擠壓出1個(gè)小坑,向其中移入一些水液或染液,將分離出的珠心等結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到水液或染液中,在解剖鏡下對(duì)其進(jìn)行觀察或制片。若需對(duì)珠心等進(jìn)行染色,可在染色后吸出染液,換上水液漂洗數(shù)次,然后進(jìn)行觀察或制片。1.3.3觀察結(jié)果的相位處理方法以及數(shù)碼照片的生成觀察結(jié)果利用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照,數(shù)碼照片僅使用word軟件進(jìn)行放大、縮小或剪切等處理,個(gè)別照片采用了光學(xué)信息解析方法進(jìn)行處理。2結(jié)果與分析2.1牡丹花內(nèi)珠被的熒光觀察從花期牡丹雌蕊群(圖版1-1)中摘下1個(gè)心皮,除去一部分子房壁暴露出胚珠(圖版1-2)。將牡丹胚珠用84消毒液進(jìn)行整體透明后,可觀察到其2層珠被中外珠被很厚,內(nèi)珠被較薄(圖版1-3)。內(nèi)珠被珠孔端的頂端不平整,由一些長(zhǎng)、短間隔排列的裂片圍成(圖版1-4)。對(duì)經(jīng)整體透明和除去外珠被的牡丹胚珠進(jìn)行觀察時(shí),可見(jiàn)內(nèi)珠被的外層顏色較淺,而最內(nèi)層珠被絨氈層顏色較深(圖版1-5)。在進(jìn)行熒光觀察時(shí),珠被絨氈層能發(fā)出清晰的綠色熒光(圖版1-6)。對(duì)牡丹胚珠的切片染色后進(jìn)行觀察,可見(jiàn)其外珠被很厚,而內(nèi)珠被較薄,內(nèi)、外珠被之間有1條平滑的分界線,這證實(shí)了外珠被易于剝離(圖版1-7,1-8)。牡丹內(nèi)珠被的厚薄不一,其最內(nèi)層是細(xì)胞徑向伸長(zhǎng)的珠被絨氈層;珠被絨氈層的著色稍深,形成一些較圓滑的縱向皺褶,交替地突入到內(nèi)珠被圍成的珠被腔中,擴(kuò)大了珠被絨氈層的表面積(圖版1-8,1-9)。珠被絨氈層的照片經(jīng)光學(xué)信息解析處理后,徑向伸長(zhǎng)結(jié)構(gòu)更加明顯(圖版1-10)。對(duì)牡丹胚珠的切片進(jìn)行熒光和透射光同時(shí)觀察時(shí),僅珠被絨氈層能發(fā)出清晰的綠色熒光,在切片上還發(fā)現(xiàn)內(nèi)珠被外層與珠被絨氈層易于脫離,這證實(shí)了可通過(guò)顯微解剖方法將內(nèi)珠被外層除去(圖版1-11)。將除去外珠被和內(nèi)珠被外層的珠心進(jìn)行熒光觀察時(shí),可觀察到珠被絨氈層發(fā)出清晰的熒光(圖版1-12)。除去內(nèi)珠被外層后,在珠被絨氈層的剝離面上,可觀察到珠被絨氈層的縱向垂周壁上有淺波狀皺褶(圖版1-13)。2.2牡丹花珠心剖相將新鮮的牡丹胚珠粘在解剖鏡下的膠塊上(圖版1-14),將外珠被縱向剖開(kāi)、掀開(kāi),暴露出內(nèi)珠被(圖版1-15,用染液對(duì)其染色)。除去外珠被的胚珠呈長(zhǎng)卵形,珠孔端較細(xì)(圖版1-16,1-17)。對(duì)其進(jìn)行染色、制片,可見(jiàn)其具有2層結(jié)構(gòu),外層為內(nèi)珠被外層,內(nèi)層為珠被絨氈層及珠心(圖版1-18)。將外珠被和內(nèi)珠被外層除去后,可獲得外層為珠被絨氈層的牡丹珠心,將其懸浮在水液中,在解剖鏡下觀察呈橢球狀,其表面不光滑,珠孔端有1個(gè)較寬闊的開(kāi)口(圖版1-19)。將此珠心制成水裝片后,由于無(wú)法懸浮、受自身重力和擠壓作用,便失去原有形態(tài),成扁平狀,在其2層結(jié)構(gòu)中,外層色深,為珠被絨氈層,內(nèi)層為珠心(圖版1-20)。當(dāng)縱向依次剖開(kāi)、掀開(kāi)并除去一部分外珠被、內(nèi)珠被外層和珠被絨氈層后,便暴露出珠被腔中的珠心(圖版1-21)。將分離出來(lái)的珠心移入水液中,可見(jiàn)其呈橢球狀,表面光滑(圖版1-22)。制片時(shí),由于失去浮力、受自身重力和擠壓作用,珠心失去原有形態(tài),成扁平狀(圖版1-23)。3牡丹花珠心的分離牡丹胚珠具有2層珠被,其外珠被很厚,容易除去,而內(nèi)珠被的外層容易與珠被絨氈層脫離并除去,但除去珠被絨氈層的難度稍大。在牡丹的胚珠中,只有珠被絨氈層能夠發(fā)出清晰的熒光。在解剖鏡下,利用膠塊依次將牡丹胚珠的外珠被、內(nèi)珠被外層和珠被絨氈層除去后,可分離出具有原有形態(tài)的牡丹珠心。在非酶法分離牡丹珠心時(shí),分別要除去外珠被、內(nèi)珠被外層、珠被絨氈層3層結(jié)構(gòu),其剝離的難度依次增加。在牡丹胚珠中,只有珠被絨氈層能夠發(fā)出清晰的熒光,在進(jìn)行珠心分離時(shí)可依此檢測(cè)分