第八章蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定

第1頁(yè)，共89頁(yè)。第

一

節(jié)

概

述

蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、Cu、Fe、I等。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體11%~13%總熱量來(lái)自蛋白質(zhì)。無(wú)論動(dòng)物、植物都含有蛋白質(zhì)，只是含量及類(lèi)型不同。蛋白質(zhì)是食品的最重要質(zhì)量指標(biāo)，其含量與分解產(chǎn)物直接影響食品的色、香、味。

第2頁(yè)，共89頁(yè)。一般說(shuō)來(lái)，動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為20.0%左右，豬肉9.5%,兔肉21%,雞肉20%，牛乳3.5%,帶魚(yú)18.0%,大豆40%，面粉9.9%,菠菜2.4%,黃瓜1.0%,蘋(píng)果1.4%。

第3頁(yè)，共89頁(yè)。第二節(jié)蛋白質(zhì)的定量測(cè)定測(cè)定食品中的蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，合理開(kāi)發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過(guò)程控制均具有極其重要的意義。蛋白質(zhì)測(cè)定方法分兩大類(lèi)：一類(lèi)是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測(cè)定蛋白質(zhì)含量另一類(lèi)是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳香基團(tuán)等測(cè)定蛋白質(zhì)含量。第4頁(yè)，共89頁(yè)。具體測(cè)定方法有：①凱氏定氮法②雙縮脲法③染料結(jié)合法④酚試劑法⑤紫外分光光度法⑥水揚(yáng)酸比色法⑦折光法⑧旋光法第5頁(yè)，共89頁(yè)。

蛋白質(zhì)的測(cè)定，目前多采用將蛋白質(zhì)消化，測(cè)定其含氮量，再乘一個(gè)蛋白質(zhì)換算系數(shù)換算為蛋白質(zhì)含量的凱氏定氮法。不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量不同，所以不同食品的蛋白質(zhì)換算系數(shù)有所不同。

第6頁(yè)，共89頁(yè)。

一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值稱(chēng)為蛋白質(zhì)系數(shù)，不同種類(lèi)食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米，蕎麥，青豆，雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70，牛乳及其制品為6.38。

第7頁(yè)，共89頁(yè)。在食品和生物材料中的氮包括蛋白質(zhì)氮，還包括有非蛋白質(zhì)氮，如核酸、含氮碳水化合物、生物堿、含氮類(lèi)脂、卟啉和含氮的色素等,所以凱氏定氮法測(cè)定的只能稱(chēng)為粗蛋白含量。第8頁(yè)，共89頁(yè)。一、凱氏定氮法

凱氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，是測(cè)定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡(jiǎn)單的方法之一，可用于所有動(dòng)、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，故國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個(gè)經(jīng)典分析方法，至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法?，F(xiàn)發(fā)展為常量、微量、半微量法、改良凱氏法及自動(dòng)定氮儀法。書(shū)中只介紹前三種。

第9頁(yè)，共89頁(yè)。（一）常量凱氏定氮法（1）原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。Ⅰ）用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。Ⅱ也可以用過(guò)量的標(biāo)準(zhǔn)H2SO4或標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定過(guò)量的酸。第10頁(yè)，共89頁(yè)。整個(gè)過(guò)程分三步：消化、蒸餾與吸收、滴定。

①

消化

濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮。濃硫酸又具有氧化性，將有機(jī)物炭化后的碳化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。

H2SO4＋2NH3＝(NH4)2SO4

第11頁(yè)，共89頁(yè)。2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4

（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（98%）總反應(yīng)式：第12頁(yè)，共89頁(yè)。為了加快消化速度，縮短消化時(shí)間常加入以下物質(zhì)硫酸鉀：加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度一般純硫酸的沸點(diǎn)在340℃左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高到400℃以上，原因主要在于隨著消化過(guò)程中硫酸不斷地被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大，故沸點(diǎn)升高，其反應(yīng)式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3第13頁(yè)，共89頁(yè)。但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過(guò)高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：

（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4

2(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O除硫酸鉀外也可加入無(wú)水硫酸鈉，氯化鉀等鹽類(lèi)來(lái)提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。第14頁(yè)，共89頁(yè)。Ⅰ催化劑C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

Ⅱ指示消化終點(diǎn)的到達(dá)此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色,可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá)。Ⅲ下一步蒸餾時(shí)作為堿性反應(yīng)（加堿是否足量）的指示劑?？梢约友趸?、汞（均有毒，價(jià)格貴）、硒粉、二氧化鈦來(lái)代替硫酸銅。硫酸銅:第15頁(yè)，共89頁(yè)。氧化劑：如雙氧水、次氯酸鉀、高錳酸鉀等加速有機(jī)物氧化速度。消化時(shí)要防止爆沸，直到消化到溶液的顏色為藍(lán)綠色或綠色透明為止。第16頁(yè)，共89頁(yè)。②蒸餾與吸收

在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉（40%）使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣，用4%硼酸吸收或用過(guò)量的H2SO4

或HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，反應(yīng)方程式如下：Ⅰ）用硼酸吸收2NaOH＋(NH4)2SO4＝2NH3↑＋Na2SO4＋2H2O2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

Ⅱ）用過(guò)量的H2SO4

或HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收2NaOH＋(NH4)2SO4＝2NH3↑＋Na2SO4＋2H2O2NH3＋

H2SO4（或HCl）＝(NH4)2SO4（或NH4Cl）第17頁(yè)，共89頁(yè)。③滴定Ⅰ）加熱蒸餾所放出的氨，用4%硼酸吸收完全后，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅—溴甲基酚綠混合指示劑）國(guó)標(biāo)用亞甲基蘭+甲基紅。指示劑紅色綠色紅色（酸）（堿）（酸）因硼酸呈微弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，但它有吸收氨的作用，滴定的反應(yīng)方程式如下：

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3吸收滴定第18頁(yè)，共89頁(yè)。Ⅱ）用過(guò)量的H2SO4或HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過(guò)剩的酸液，用甲基紅指示劑。第19頁(yè)，共89頁(yè)。以“奈氏試劑”檢查氨是否全部蒸完。奈氏試劑——〔Nessler試劑，K2（HgI4）〕檢驗(yàn)NH4+離子，遇銨根，離子析出黃色或紅棕色沉淀。第20頁(yè)，共89頁(yè)。(2)儀器①500ml凱氏燒瓶②常量定氮蒸餾裝置(3)試劑

①硫酸銅②硫酸鉀③硫酸④

40g∕L硼酸溶液；⑤混合指示劑：1g∕L甲基紅乙醇溶液與1g∕L甲基藍(lán)乙醇溶液，臨用時(shí)按2：1的比例混合?；蛘?g∕L甲基紅乙醇溶液與1g∕L溴甲酚綠乙醇溶液，臨用時(shí)按1：5的比例混合；⑥400g∕L氫氧化鈉；⑦0.1mol∕L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液第21頁(yè)，共89頁(yè)。

（4）操作步驟樣品消化、蒸餾與吸收、滴定三步。第22頁(yè)，共89頁(yè)。

①

樣品消化

準(zhǔn)確稱(chēng)取均勻的固體樣品0.5～3g,或半固體樣品2～5g,或吸取溶液樣品15～25ml。小心移入干燥的凱氏燒瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5～1g硫酸銅、10g硫酸鉀及25ml濃硫酸，小心搖勻后，于瓶口置一小漏斗，瓶頸45°角傾斜置電爐上，在通風(fēng)櫥內(nèi)加熱消化。先以小火緩慢加熱，待內(nèi)容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈藍(lán)綠色。取下漏斗，繼續(xù)加熱0.5h，冷卻至室溫。第23頁(yè)，共89頁(yè)。第24頁(yè)，共89頁(yè)。第25頁(yè)，共89頁(yè)。②蒸餾吸收

按圖裝好蒸餾裝置，冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶?jī)?nèi)預(yù)先裝有50ml40

g∕L硼酸溶液及混合指示劑5~6滴）。

在凱氏燒瓶?jī)?nèi)加入100ml蒸餾水、玻璃珠數(shù)粒，從安全漏斗中慢慢加入70ml400g/L氫氧化鈉，溶液應(yīng)呈藍(lán)褐色。不要搖動(dòng)，將定氮球連接好。用直火加熱蒸餾30min，將蒸餾裝置出口離開(kāi)液面繼續(xù)蒸餾1min，用蒸餾水淋洗尖端后停止蒸餾。

第26頁(yè)，共89頁(yè)。常量凱氏定氮蒸留裝置第27頁(yè)，共89頁(yè)。第28頁(yè)，共89頁(yè)。③滴定

將接受瓶?jī)?nèi)的硼酸液用0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。同時(shí)做一試劑空白（除不加樣品，從消化開(kāi)始操作完全相同）。

第29頁(yè)，共89頁(yè)。(5)結(jié)果計(jì)算式中：

W—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；c—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；V1—空白滴定消耗酸標(biāo)準(zhǔn)液量，mL；V2—樣液滴定消耗酸標(biāo)準(zhǔn)液量，mL；m—樣品質(zhì)量，g；0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；F—蛋白質(zhì)系數(shù)。第30頁(yè)，共89頁(yè)。（6）注意事項(xiàng)：①所用試劑溶液應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制,凱氏燒瓶和小漏斗必須是干燥的。②消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物在無(wú)硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。③消化時(shí)應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪拢⒋龠M(jìn)其消化完全。

第31頁(yè)，共89頁(yè)。

④樣品中若含糖、脂肪較多時(shí)，消化過(guò)程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開(kāi)始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。⑤當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30％過(guò)氧化氫2-3m1后再繼續(xù)加熱消化。⑥若取樣量較大，如干試樣超過(guò)5g可按每克試樣5m1的比例增加硫酸用量。第32頁(yè)，共89頁(yè)。

⑦—般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品．如含賴(lài)氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。⑧蒸餾裝置不能漏氣,小漏斗要用水封保持其氣密性。蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源．否則可能造成吸收液倒吸。第33頁(yè)，共89頁(yè)。⑨蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。氫氧化銅在70～90℃時(shí)發(fā)黑。⑩硫酸銅最好除去結(jié)晶水后再用。第34頁(yè)，共89頁(yè)。（二）微量凱氏定氮法(1)原理

微量凱氏定氮法的原理與操作方法，與常量法基本相同，所不同的是樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套適于微量測(cè)定的定型儀器——微量凱氏定氮器。第35頁(yè)，共89頁(yè)。(2)儀器①100ml凱氏燒瓶。②微量凱氏定氮器。

第36頁(yè)，共89頁(yè)。(3)試劑①

20g/L硼酸溶液。②

400g/L氫氧化鈉。③

1g/L甲基紅乙醇溶液與1g/L溴甲酚綠

乙醇溶液，臨用時(shí)按1：5混合。④0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液⑤其他試劑同常量法。第37頁(yè)，共89頁(yè)。(4)操作步驟①

樣品消化

樣品消化步驟同常量法。將消化完全的消化液冷卻后，完全轉(zhuǎn)入100容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。

第38頁(yè)，共89頁(yè)。第

一

節(jié)

概

述在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關(guān)系，可作定量測(cè)定。氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.蛋白質(zhì)可以被酶、酸或堿水解，其水解的最終產(chǎn)物為氨基酸。奈氏試劑——〔Nessler試劑，K2（HgI4）〕檢驗(yàn)NH4+離子，遇銨根，離子析出黃色或紅棕色沉淀。此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色,可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá)。W——測(cè)定得樣品溶液相當(dāng)于樣品的量（g）水楊酸比色法等。比色后從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其蛋白質(zhì)濃度，再按照稀釋倍數(shù)求出樣品的蛋白質(zhì)含量。雙縮脲法、Ⅲ下一步蒸餾時(shí)作為堿性反應(yīng)（加堿是否足量）的指示劑。2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O加入甲醛溶液后，與—NH2—結(jié)合，堿操作同前，平行做兩份。②蒸餾吸收

按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水至2/3容積處，加甲基紅指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈紅色，加入數(shù)粒玻璃珠，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水。在接受瓶?jī)?nèi)加入10ml20g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。第39頁(yè)，共89頁(yè)。

樣品由進(jìn)樣漏斗進(jìn)入反應(yīng)室，以少量水沖洗進(jìn)樣漏斗，并流入反應(yīng)室。再?gòu)倪M(jìn)樣口加入10ml400g/L氫氧化鈉使呈強(qiáng)堿性，用少量蒸餾水洗漏斗數(shù)次，蓋塞，進(jìn)行水蒸氣蒸餾。蒸餾至吸收液中所加的混合指示劑酒紅色變?yōu)樘m綠色開(kāi)始記時(shí)，繼續(xù)蒸餾10-15min后，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。第40頁(yè)，共89頁(yè)。微量凱氏定氮蒸留裝置第41頁(yè)，共89頁(yè)。微量凱氏定氮蒸餾裝置第42頁(yè)，共89頁(yè)。③滴定

取下接受瓶，以0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至灰紫色為終點(diǎn)。第43頁(yè)，共89頁(yè)。(5)結(jié)果計(jì)算(V1-V0)×C×0.014X=——————————×F×100V2

m×——100

第44頁(yè)，共89頁(yè)。式中：W—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；V0—滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；V1—滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；V2—蒸餾時(shí)吸取樣品稀釋液體積，mL；C—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；F—蛋白質(zhì)系數(shù)；m—樣品質(zhì)量，g。第45頁(yè)，共89頁(yè)。改良式凱氏定氮裝置第46頁(yè)，共89頁(yè)。（三）自動(dòng)凱氏定氮法1、原理同前。2、特點(diǎn)（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線(xiàn)加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置。可計(jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。第47頁(yè)，共89頁(yè)。北京福德泰和科技有限公司產(chǎn)品名稱(chēng)：凱氏定氮儀

第48頁(yè)，共89頁(yè)。二、雙縮脲法傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時(shí)間，有環(huán)境污染。新開(kāi)發(fā)的：雙縮脲法、紫外分光光度法染料結(jié)合法、水楊酸比色法等。第49頁(yè)，共89頁(yè)。1. 原理脲（尿素）NH2—CO—NH2

加熱至150-160℃時(shí)，兩分子縮和成雙縮脲。雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)合物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)）

NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3

NH2—CO—NH2

+

NH2—CO—NH2第50頁(yè)，共89頁(yè)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵—CO—NH—與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)（540nm）來(lái)測(cè)其吸光度，確定含量。注：測(cè)蛋白質(zhì)時(shí)叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲，樣品不用消化。第51頁(yè)，共89頁(yè)。

2.方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍本法靈敏度較低，但操作簡(jiǎn)單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類(lèi)、油料、米谷等作物種子及肉類(lèi)等樣品測(cè)定。

第52頁(yè)，共89頁(yè)。3.主要儀器:分光光度計(jì),離心機(jī)（4000r/min）

4.試劑：（1）標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液（5mg/ml）（2）雙縮脲試劑：溶解1.50克硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）于500ml水中，在攪拌下加入300ml10%氫氧化鈉溶液，用水稀釋到1升，貯存在內(nèi)壁涂以石臘的瓶中。第53頁(yè)，共89頁(yè)。5、操作方法①繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)取一系列試管，分別加入0，0.4,0.8,1.2,1.6,2.0ml的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液（作為標(biāo)準(zhǔn)用的應(yīng)當(dāng)用凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量,以確定酪蛋白的純度），用水補(bǔ)足到2ml，然后加入4ml雙縮脲試劑在室溫下（15℃～25℃）放置30min，于540nm波長(zhǎng)下用72型分光光度計(jì)比色測(cè)定。最后以光密度為縱坐標(biāo)，酪蛋白的含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，作為定量的依據(jù)。

第54頁(yè)，共89頁(yè)。②未知樣品蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定未知樣品必須進(jìn)行稀釋調(diào)整，使2ml中含有1～10mg蛋白質(zhì)，才能進(jìn)進(jìn)測(cè)定。吸取1ml1:10稀釋的待測(cè)液，用水補(bǔ)足到2ml。操作同前，平行做兩份。與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的各管同時(shí)比色。比色后從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其蛋白質(zhì)濃度，再按照稀釋倍數(shù)求出樣品的蛋白質(zhì)含量。第55頁(yè)，共89頁(yè)。三．紫外吸收法1．原理：由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，最大吸收峰在280nm波長(zhǎng)處。在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關(guān)系，可作定量測(cè)定。第56頁(yè)，共89頁(yè)。2．適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。3．主要儀器：①紫外分光光度計(jì)②離心機(jī)（3000—5000r/min）4．試劑（1）標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)凱氏定氮法校正的結(jié)晶牛血清蛋白，配制成濃度為1mg/mL的溶液。（2）待測(cè)蛋白質(zhì)溶液：濃度為1mg/mL左右的溶液。第57頁(yè)，共89頁(yè)。5．操作：①標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：用凱氏法測(cè)定蛋白質(zhì)純度的標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).分別向8支試管內(nèi)依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(1mg/mL)0,0.5,1.0,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,再加入蒸餾水至總體積為4mL(相當(dāng)于蛋白質(zhì)濃度為0.125,0.25,0.375,0.50,0.6250.75,1.0mg/mL，混勻。以光程為1cm的石英比色杯，在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。第58頁(yè)，共89頁(yè)。②樣品測(cè)定取待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1mL，加入蒸餾水3mL，混勻，按上述方法測(cè)定280nm的光密度，并從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)上查出待測(cè)蛋白質(zhì)溶液的濃度。第59頁(yè)，共89頁(yè)。6、注意事項(xiàng)紫外吸收法測(cè)蛋白質(zhì)含量迅速、簡(jiǎn)便、不消耗樣品，低濃度鹽類(lèi)不干擾測(cè)定。因此，已在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用280nm進(jìn)行紫外檢測(cè)，來(lái)判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況。但該法的缺點(diǎn)是對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)，若樣品中含有嘌呤、嘧啶（也就是說(shuō)樣品中含有較多量的核酸）等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大干擾。第60頁(yè)，共89頁(yè)。

蛋白質(zhì)可以被酶、酸或堿水解，其水解的最終產(chǎn)物為氨基酸。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，雖然從各種天然源中分離得到的氨基酸已達(dá)175種以上，但是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其中的20種，而在構(gòu)成的氨基酸中，亮氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸、苯丙氨算、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8種氨基酸在人體中不能合成，必須依靠食品供給，故被稱(chēng)為必需氨基酸，它們對(duì)人體有著極其重要的生理功能，常會(huì)因其在體內(nèi)缺乏而導(dǎo)致患病或通過(guò)補(bǔ)充而增強(qiáng)了新陳代謝作用。第

四

節(jié)氨

基

酸

測(cè)

定

第61頁(yè)，共89頁(yè)。

隨著食品科學(xué)的發(fā)展和營(yíng)養(yǎng)知識(shí)的普及，食物蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的構(gòu)成，愈來(lái)愈得到人們的重視。為提高蛋白質(zhì)的生理效價(jià)而進(jìn)行食品氨基酸互補(bǔ)和強(qiáng)化的理論，對(duì)食品加工工藝的改革，對(duì)保健食品的開(kāi)發(fā)及合理配膳等工作都具有積極的指導(dǎo)作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分離、鑒定和定量也就具有極其重要的意義。第62頁(yè)，共89頁(yè)。一、雙指示劑甲醛滴定法1.原理氨基酸本身有堿性—NH2—基，又有酸性—COOH基，成中性?xún)?nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與—NH2—結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來(lái)滴定—COOH基,用間接的方法測(cè)定氨基酸的總量。第63頁(yè)，共89頁(yè)。2．方法特點(diǎn)及適用范圍此法簡(jiǎn)單易行、快速方便，在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測(cè)定發(fā)酵液中氨基酸含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。脯氨酸與甲醛作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏高。（適于食品中游離氨基酸的測(cè)定）第64頁(yè)，共89頁(yè)。3．試劑：①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至藍(lán)色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液，③0.1%中性紅50%乙醇溶液，④0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。第65頁(yè)，共89頁(yè)。4．操作步驟稱(chēng)取粉碎樣品5-10克或液體樣品5-10mL，置于燒杯中，加入50mL水和活性炭5克，加熱煮沸過(guò)濾，用30-40mL熱水洗滌活性炭，收集濾液于三角瓶中，取樣品溶液2份。

第66頁(yè)，共89頁(yè)。①+3滴中性紅指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴至由紅變?yōu)殓晟珵榻K點(diǎn)（中性紅pH=7琥珀色），中和樣液中其它酸性物質(zhì)。（游離酸）。②+3滴百里酚酞+中性甲醛20ml，搖勻，靜置1分鐘，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色為終點(diǎn)（百里酚酞淡藍(lán)色），中和了樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)的總和。（氨基酸+游離酸）二者之差可計(jì)算樣品中氨基酸含量。第67頁(yè)，共89頁(yè)。5、結(jié)果計(jì)算氨基酸態(tài)氮（%）第68頁(yè)，共89頁(yè)。式中：c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;V1——用中性紅作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;V2——用百里酚酞作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;m——測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g0.014——氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol

第69頁(yè)，共89頁(yè)。6、注意事項(xiàng)①適用于有色樣品，加活性炭脫色。②加甲醛后立即滴定，不能放太久，防止甲醛聚合生成白色渾濁聚合物。③樣品中含有酸式碳酸鹽時(shí)必須先加0.1mol/L的氫氧化鋇中和沉淀它后再加甲醛用氫氧化鈉滴定。第70頁(yè)，共89頁(yè)。二、單指示劑甲醛滴定法操作：①稱(chēng)取粉碎樣品5-10克或液體樣品5-10mL，置于燒杯中，加入50mL水和活性炭5克，加熱煮沸過(guò)濾，用30-40mL熱水洗滌活性炭，收集濾液于三角瓶中。②在三角瓶中加入百里酚酞3滴，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡蘭色為終點(diǎn)，記下所用的氫氧化鈉的體積數(shù)V1。（滴定樣品中自然存在的游離酸）③再在以上的三角瓶中加入甲醛10mL，快速搖勻，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液再滴定至淡蘭色為終點(diǎn)，記下所用的氫氧化鈉的體積數(shù)V2。第71頁(yè)，共89頁(yè)。

本法與雙指示劑法相比，只用了一種指示劑，在滴定時(shí)存在微量過(guò)量，準(zhǔn)確度比雙指示劑法稍差。第72頁(yè)，共89頁(yè)。

式中：c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;V1——用百里酚酞作指示劑滴定樣品中自然存在的游離酸時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;V2——用百里酚酞作指示劑滴定氨基酸+游離酸時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;m——測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g0.014——氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol結(jié)果計(jì)算氨基酸態(tài)氮（%）第73頁(yè)，共89頁(yè)。三、電位滴定法1.原理將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到酸度計(jì)指示的pH值為8.2為終點(diǎn)，記下所用的氫氧化鈉的體積數(shù)V1,此時(shí)滴定的是游離酸,根據(jù)氨基酸的兩性作用,再加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，繼續(xù)用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到酸度計(jì)指示的pH值為9.2為終點(diǎn),此時(shí)滴定的是氨基酸。第74頁(yè)，共89頁(yè)。2.儀器附磁力攪拌器的酸度計(jì);25mL酸式滴定管;10mL胖肚吸管。第75頁(yè)，共89頁(yè)。3.試劑酚酞乙醇指示液：1%硼砂（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）緩沖液：PH9.22甲醛：36%-----38%氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.0500mol/L第76頁(yè)，共89頁(yè)。4.試驗(yàn)步驟①吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20.0mL至燒杯中，加60mL水，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2（記下消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，可計(jì)算游離酸含量）。第77頁(yè)，共89頁(yè)。W—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；m——測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至灰紫色為終點(diǎn)。014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；以“奈氏試劑”檢查氨是否全部蒸完。（2）雙縮脲試劑：溶解1.氫氧化銅在70～90℃時(shí)發(fā)黑。C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)的溶液繼續(xù)滴定至pH9.⑥400g∕L氫氧化鈉；硼砂（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）緩沖液：PH9.⑦—般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品．如含賴(lài)氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。②加入0.1mL甲醛溶液，混勻。再用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)的溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記下消耗0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)（