分析化學——藥用化學基礎第十五章??高效液相色譜法

高效液相色譜儀高效液相色譜法概述01020304目錄

高效液相色譜法的定性、定量分析

高效液相色譜法的應用2008年，三聚氰胺超標事件是一起食品安全事故。事故起因是很多食用三鹿集團生產(chǎn)的奶粉的嬰兒被發(fā)現(xiàn)患有腎結石，隨后在其奶粉中發(fā)現(xiàn)化工原料三聚氰胺。在三鹿嬰幼兒奶粉事件發(fā)生后，國家批準發(fā)布了《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》國家標準，標準規(guī)定了高效液相色譜法、氣相色譜—質譜聯(lián)用法、液相色譜—質譜／質譜法三種方法為三聚氰胺的檢測方法。學習導學什么是高效液相色譜法？它與氣相色譜法有何區(qū)別？它在食品、藥品、工業(yè)分析中有什么作用呢？學習導學§15-1高效液相色譜法概述學習目標1.掌握高效液相色譜法的特點。2.熟悉高效液相色譜法流動相的要求以及預處理的方法。3.了解高效液相色譜法的原理。高效液相色譜法(HPLC)又稱為高壓液相色譜法或高速液相色譜法，是采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。高效液相色譜法在藥品研發(fā)、生產(chǎn)、質量控制、監(jiān)督等領域中有廣泛的應用。一、高效液相色譜法的原理1.原理用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱。注入的供試品由流動相帶入色譜柱內，各組分在柱內被分離，并進入檢測器檢測，對供試品進行分離測定。一、高效液相色譜法的原理2.固定相高效液相色譜法使用最多的是化學鍵合相色譜法。（1）鍵合相種類非極性鍵合相:C18、C8、C1、ODS弱極性鍵合固定相:醚基和二羥基鍵合相極性鍵合相:氨基、氰基鍵合相一、高效液相色譜法的原理（2）鍵合相特點化學穩(wěn)定性好，使用過程中不流失；均一性和重現(xiàn)性好；柱效高，分離選擇性好；適于梯度洗脫；載樣量大。（3）注意事項流動相中水相的pH值2～8。一、高效液相色譜法的原理3.流動相（1）HPLC對流動相的基本要求不與固定相發(fā)生化學反應;對試樣有適宜的溶解度;與檢測器相適應;純度要高，黏度要小;微孔濾膜過濾，脫氣。一、高效液相色譜法的原理3.流動相（2）流動相的極性和強度反相色譜系統(tǒng)：甲醇—水、乙腈—水，

流動相極性越強，洗脫能力越強。正相色譜系統(tǒng)：二氯甲烷—正己烷，流動相極性越強，洗脫能力越低。一、高效液相色譜法的原理3.流動相（3）流動相的預處理用符合液相色譜純度要求的試劑配制流動相；使用前經(jīng)微孔濾膜（0.45μｍ或0.22μｍ）過濾；流動相使用前必須脫氣；儲存于玻璃、聚四氟乙烯等容器內。二、高效液相色譜法的特點及分類1.特點分離效能高、選擇性好、分析速度快、檢測靈敏度高、自動化程度高。（1）應用范圍廣。（2）流動相選擇性高。（3）室溫條件下操作。二、高效液相色譜法的特點及分類2.分類（1）液固吸附色譜法（2）液液分配色譜法（3）離子交換色譜法（4）離子對色譜法（5）分子排阻色譜法§15-2高效液相色譜儀學習目標1.熟悉高效液相色譜儀的分析依據(jù)和工作流程。2.掌握高效液相色譜儀的組成、主要部件的名稱與作用。高效液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。

高效液相色譜儀主要包括高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)。一、高效液相色譜儀的組成一、高效液相色譜儀的組成１.高壓輸液系統(tǒng)（１）高壓輸液泵用于完成流動相的輸送任務，可分為恒壓泵和恒流泵，多用恒流泵中的柱塞往復泵。高壓輸液泵一、高效液相色譜儀的組成（２）梯度洗脫裝置等強度洗脫：同一個分析周期內流動相組成保持恒定。梯度洗脫：一個分析周期內以程序控制改變流動相的組成。一、高效液相色譜儀的組成2.進樣部分安裝在色譜柱的進口處，將試樣引入色譜柱。常用六通閥進樣器和自動進樣器。自動進樣器一、高效液相色譜儀的組成3.分離系統(tǒng)包括色譜柱、連接管、恒溫器等。色譜柱作用是分離，由柱管和固定相組成。色譜柱一、高效液相色譜儀的組成4.檢測系統(tǒng)紫外—可見分光檢測器（UVD）熒光檢測器（FLD）電化學檢測器（ECD）示差折光檢測器（RID）UVD

→色譜柱→樣品在柱中分離→各組分依次進入檢測器→顯示器輸出色譜圖。二、高效液相色譜儀的工作流程流動相（儲存于儲液瓶中）待測樣品1.準備工作：流動相，色譜柱，樣品溶液，檢查儀器。2.開機、參數(shù)設定及平衡系統(tǒng)：接通電源，啟動工作站軟件，更換流動相，排氣泡，參數(shù)設定，平衡系統(tǒng)。3.檢測：進樣，測定，記錄色譜圖。4.清洗系統(tǒng)，關機。三、高效液相色譜儀一般操作規(guī)程1.正相鍵合相色譜法的分離條件（1）固定相：極性鍵合相為固定相，如氰基、氨基等。（2）流動相：烷烴加適量極性調節(jié)劑。四、高效液相色譜條件的選擇2.反相鍵合相色譜法的分離條件（1）固定相：非極性鍵合相，如ODS（2）流動相：甲醇—水、乙腈—水（3）pH值：2～8（4）流動相的離子強度：加入0.1％～1％的醋酸鹽、磷

酸鹽等。四、高效液相色譜條件的選擇五、高效液相色譜法系統(tǒng)適用性試驗包括理論板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復性等五個參數(shù)。不得改變：填充劑種類、流動相組分、檢測器類型。可改變：色譜柱內徑與長度、填充劑粒徑、流動相流速、流動相組分比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度等?！?5-3高效液相色譜法的定性、定量分析學習目標1.掌握高效液相色譜法的定性、定量分析方法。2.熟悉高效液相色譜法的定量分析方法要求。一、定性分析方法1.利用保留時間定性定性的依據(jù)：在相同的色譜條件下，待測成分的保留時間與對照品的保留時間應無顯著性差異。注意：兩個保留時間不同的色譜峰歸屬于不同化合物，兩個保留時間一致的色譜峰不一定是同一化合物。一、定性分析方法2.利用光譜相似度定性3.利用質譜檢測器提供的質譜信息定性人造色素質譜圖二、定量分析方法1.方法要求（1）流動相應用高純度試劑配制，水為高純水。（2）流動相和樣品經(jīng)0.45μｍ濾膜濾過，脫氣。（3）系統(tǒng)適用性試驗。（4）雜質檢查調節(jié)儀器的靈敏度，色譜記錄時間足夠。二、定量分析方法1.方法要求（5）含量測定，RSD≤1.5%。（6）紫外檢測器的檢測波長＞溶劑的截止波長。（7）實驗結束，沖洗系統(tǒng)。二、定量分析方法2.定量分析方法（1）外標法二、定量分析方法2.定量分析方法（2）內標法二、定量分析方法2.定量分析方法（3）內加法將待測物i的純品加至待測樣品中，測定增加純品后的溶液比原樣品溶液中i組分的峰面積增量，來求算i組分含量的定量分析方法?！?5-4高效液相色譜法的應用學習目標了解高效液相色譜法在藥品檢驗中的應用。一、中藥中有效成分的分離、鑒定示例小兒熱速清口服液中黃芩苷的鑒別色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇—水—磷酸（47：53：0.2）為流動相；檢測波長為276nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計算應不低于2500。二、含量測定示例鹽酸小檗堿片中主成分鹽酸小檗堿的含量測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液[0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液和0.05mol/L庚烷磺酸鈉溶液(1:1)，含0.2%三乙胺，并用磷酸調節(jié)pH值至3.0]—乙腈(60:40)為流動相；檢測波長為263nm；進樣體積為20μL。理論板數(shù)按小檗堿峰計算不低于3000，小檗堿峰與相鄰雜質峰之間的分離度應符合要求。三、藥物中雜質的檢