大鼠慢性后路缺血模型的制備及評價

動脈粥樣硬化和其他原因引起的慢性動脈缺血性病變是罕見的，治療困難。這是血管外科的熱點。各種治療手段都需經(jīng)動物模型進行觀察和驗證,目前采用的動物模型是在切除或者結扎動物后肢動脈的基礎上造成急性缺血的過程,其病理變化和患肢的代償機理顯然同臨床慢性下肢缺血有明顯差別,故建立一種肢體慢性缺血狀態(tài)的動物模型有著重要的應用價值。1材料和方法1.1periflux激光多普勒血流檢測儀器21只SPF級雄性Lewis大鼠,鼠齡4周,體重200~350g,平均245g,首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院動物實驗中心提供。Periflux激光多普勒血流探測儀,首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院血管外科研究所;PeriScanPIM3激光多普勒血流灌注成像儀,瑞典百靈威醫(yī)療儀器中國公司;Lecia顯微圖像分析系統(tǒng),德國徠卡儀器有限公司;大鼠α-actin免疫組織化學試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司;手術顯微鏡,首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院再生醫(yī)學實驗室提供。1.2大鼠左髂動脈切除20只Lewis大鼠采用隨機數(shù)字表的方法隨機分為急性缺血組(n=10)和慢性缺血組(n=10),另1只大鼠行左髂動脈切除+左股動脈切除術。1.3模型生產(chǎn)1.3.1股動脈并結晶股用10%水合氯醛溶液3μl/kg腹腔注射麻醉(后同),仰臥固定,左后肢常規(guī)備皮消毒,縱行切開左后肢正中皮膚,于腹股溝下分離出股動脈,范圍從腹股溝韌帶直至膝關節(jié)。結扎股動脈及其于股部的所有分支。將股動脈于腹股溝韌帶下切斷,雙重結扎近端,隨后向遠端銳性剝離至膝關節(jié),結扎腘動脈及腓動脈,術畢,縫合切口。1.4觀察指標1.4.1血指數(shù)評估每只動物分別于術后第1、7、14、21、28及48天參照文獻的方法行臨床缺血指數(shù)(clinicalischemiaindex)評估:0分為正常,1分為患肢蒼白,2分為肢體血壓下降,3分為肢體壞死或跛行。于術后第7天應用PeriScanPIM3激光多普勒血流灌注成像儀檢測肢體血流灌注情況。1.4.3腹主動脈形成分析分別于術后第7、14、28、42及49天,以上2組2只大鼠行后肢血流量測定之后,經(jīng)腹腔水合氯醛溶液注射麻醉,開腹分離腹主動脈后進行穿刺并留管,經(jīng)留置管注射肝素生理鹽水后,以2.5ml/s的速率注射造影劑(泛影葡胺)共5ml,同時對雙后肢連續(xù)拍照,用數(shù)字減影的方法處理造影結果。結果分析:以腹主動脈分叉處顯影后1.5s時的照片為依據(jù),計算通過右股骨中點垂直線的血管數(shù)目,表示側支血管開放的程度。由兩位獨立的觀察者對垂直通過股骨中點的側支血管進行計數(shù)。1.4.4雙術后股動脈、石蠟包埋及染色每組大鼠在術后第7、14、28、42及49天進行后肢DSA后,采用加大麻醉劑量的方法處死大鼠。取大鼠雙后肢股四頭肌、腓腸肌中段及線栓處之股動脈,采用甲醛固定、石蠟包埋,用蘇木精及伊紅(HE)染色。另外對術后第7天(n=2)所取的組織行α-actin免疫組織化學染色,光鏡下2組各取3個視野,輔以Lecia顯微圖像分析系統(tǒng)觀察單位視野內(nèi)棕色顆粒數(shù)即陽性細胞數(shù),以單位視野內(nèi)陽性細胞數(shù)/肌纖維數(shù)表示小動脈密度。2結果2.1術后平均心肌缺血指數(shù)評分急性缺血組術后表現(xiàn)為:后肢跛行2只,紫紺2只,蒼白3只,肌肉萎縮1只,未發(fā)現(xiàn)后肢壞死,另外2只正常;在術后14d內(nèi)平均缺血指數(shù)評分為2分,在48d為1分。另1只行左側髂動脈切除+左股動脈切除術的大鼠,術后第1天即出現(xiàn)患側后肢的缺血壞死,3d后死亡。慢性缺血組術后表現(xiàn)為:后肢跛行1只,紫紺1只,蒼白1只,肌肉萎縮2只,另外5只正常,沒有出現(xiàn)后肢缺血的臨床表現(xiàn)。2.2急性使用與慢性心肌病患者的血流灌注成像儀檢查術后第7天,采用隨機數(shù)字表法分別于急性缺血組和慢性缺血組隨機抽取1只大鼠進行激光多普勒血流灌注成像儀檢查,見急性缺血組患側肢體血流明顯減少,而慢性缺血組患側肢體仍有血流灌注(圖1)。2.3術后基本恢復急性缺血組患側后肢血流灌注量在術后第7天出現(xiàn)下降,在術后第28天達到最低點,為健側后肢的40%;在術后第49天基本恢復正常(ABI=1),見圖2A。慢性缺血組患側后肢血流量下降速度慢于急性缺血組,并出現(xiàn)一段時間的平臺期;后肢血流灌注量在術后第14天出現(xiàn)最低點,為健側后肢的50%,隨后患側后肢的血流量逐漸恢復,但在術后第49天其血流量只恢復到健側的70%,見圖2B。2.42sda組動物模型的結果2.4.1兩組不同部位患側側支血管數(shù)量變化DSA結果顯示,患側遠端無主干血管顯影,患肢在術后第14天,股部即出現(xiàn)側支循環(huán)開放(圖3A),表現(xiàn)為患側側支小血管數(shù)量多于健側;在術后第42天達到高峰,患側側支血管數(shù)量明顯多于健側;在術后第49天兩側側支血管數(shù)量基本相同。行左側髂動脈+股動脈切除術動物的DSA結果顯示:患肢無血管顯影,亦未見側支循環(huán)建立(圖3B)。2.4.2管基本信息DSA結果顯示,在術后第7天,所栓塞的血管基本顯影,但是存在部分的充盈缺損(圖3C);在術后第14天,仍有部分血管顯影,但造影劑顏色變淡,遠端顯影不佳(圖3D)。2.4.3兩側肢體側支血管計數(shù)比較結果見圖3E及3F。由圖3E及3F可見,急性缺血組術后第7天(早期)至術后第28天患側肢體側支血管計數(shù)均高于健側,術后第42天及49天(晚期)兩側肢體側支血管計數(shù)的差異不大。慢性缺血組術后第7天(早期)及第14天患側肢體側支血管計數(shù)均低于健側,術后第28天至第49天(晚期)患側肢體側支血管計數(shù)高于健側,但兩側肢體側支血管計數(shù)的差異不大。2.52動物組織研究2.5.1術后肌肉結構的破壞①急性缺血組:大部分(n=8)肌肉組織未發(fā)現(xiàn)明顯的壞死表現(xiàn);1只術后第7天缺血肌肉組織出現(xiàn)點狀壞死,表現(xiàn)為細胞漿均勻一致(圖4A);1只術后第28天出現(xiàn)肌肉結構的破壞,其間有大量炎性細胞浸潤(圖4B);術后第42天患側后肢肌肉出現(xiàn)萎縮,表現(xiàn)為肌間隙明顯增加(圖4C)。②慢性缺血組:術后第28天,缺血部位肌肉組織結構完好,未發(fā)現(xiàn)肌肉壞死,但有部分大鼠(n=7)后肢肌肉尤其是腓腸肌內(nèi)可見明顯的炎性細胞浸潤(圖5A);術后第42天,部分(n=2)肌肉組織出現(xiàn)慢性萎縮性改變,表現(xiàn)為肌束間隙增加,但未發(fā)現(xiàn)明顯的纖維化改變(圖5B)。2.5.2血管內(nèi)皮病變術后第7天線栓處血管的組織學結構保持完好;術后第14天即出現(xiàn)了血管內(nèi)膜增生,但未見血栓形成;術后第42天由于血管內(nèi)膜的大量增生,導致血管幾乎完全閉塞(圖6)。2.5.3小動脈密度肌肉組織中α-actin免疫組織化學染色結果顯示:陽性染色定位于小動脈平滑肌細胞的胞漿內(nèi),小動脈染色為深棕色,呈管狀結構,分布于肌間隙(圖7和圖8)。急性缺血組術后第7天(早期)股四頭肌肌肉組織中α-actin陽性細胞數(shù)與肌纖維的比值即小動脈密度患側高于健側;慢性缺血組術后第7天患側股四頭肌肌肉組織中小動脈密度與健側比較差異不大,但低于急性缺血組;慢性缺血組患側肢體腓腸肌內(nèi)小動脈密度卻高于股四頭肌。見表1。3慢性下肢活檢動物模型有人統(tǒng)計,在美國,因為嚴重的肢體缺血而不能行手術或者介入治療的患者大概有150000人;而我國目前沒有詳細的統(tǒng)計結果。若肢體缺血不斷進展,截肢往往是最后的選擇。但是學者也在努力研究通過增加血管的新生(angiogenesis)或者是促進側支血管的開放或者建立(arteriogenesis)的方法來挽救肢體,并改善癥狀。最近有很多實驗在動物模型的基礎上取得了可喜的結果,但是隨機對照臨床試驗卻很難取得令人振奮的結果。其中一個重要的原因就是,以上實驗采用的是急性后肢缺血動物模型,該模型很難真正反映出實際臨床面臨的慢性動脈硬化閉塞癥的缺血狀態(tài)。目前,普遍采用結扎或切除大鼠后肢股動脈或髂動脈的方法來制備后肢缺血模型,該缺血模型是后肢急性缺血過程,缺點為缺血維持時間較短,而且多伴有后肢組織的壞死和潰瘍,動物容易死亡;更重要的是,其缺血過程與臨床上大量慢性下肢缺血過程完全不同。近年來,國內(nèi)外學者曾嘗試通過其他不同方法如微粒栓塞法或物理縮窄股動脈的方法等來制備動物后肢缺血模型,但是目前尚無一個公認的后肢慢性缺血模型,這也影響了對慢性下肢缺血血管新生機理的研究和治療。本研究用Prolene線線栓大鼠后肢股動脈的方法,制備大鼠慢性后肢缺血模型,不僅可以在較長的時間內(nèi)維持后肢處于缺血狀態(tài),而且組織的病理學改變和血流恢復的動態(tài)演變更接近于慢性缺血過程,從而為研究各種治療手段提供了一個良好的模型基礎。通過觀察,動物術后無死亡,少有急性下肢缺血的表現(xiàn)如肢體蒼白、無脈、麻痹等臨床稱之為的“5P”征,沒有出現(xiàn)后肢壞死。但是,在觀察晚期(42~49d)后肢肌肉有萎縮現(xiàn)象,這與臨床所見相類似。而1只行左側髂動脈切除+左股動脈切除術的大鼠,術后第1天即出現(xiàn)患側后肢的缺血壞死,3d后則死亡。3.1慢性心肌缺血對大鼠血流量的影響利用激光多普勒血流探測儀可以監(jiān)測皮膚微循環(huán)血流量。PU值為激光多普勒血流探測儀測量的基本指標,是一個表示測量深度內(nèi)局部組織微循環(huán)血流量大小的相對單位,PU值的變化直接反應了組織微循環(huán)血流量的改變,其與測量范圍內(nèi)的紅細胞移動速度和數(shù)量密切相關。有研究表明,該項檢查可以動態(tài)監(jiān)測急性大鼠缺血模型術后肢體的血流變化。本實驗發(fā)現(xiàn),慢性缺血組大鼠出現(xiàn)后肢缺血狀態(tài)慢、時間晚,但是血流下降的速度卻快于急性缺血組,而且后肢缺血狀態(tài)維持時間長,在術后第49天,其血流量仍為健側的70%;而急性缺血組在術后第49天,其缺血狀態(tài)基本恢復。結合DSA分析,在股動脈插入4-0Prolene線后,在短期內(nèi)造成了血管內(nèi)物理性狹窄,此時后肢血流仍未中斷,隨著血管腔內(nèi)產(chǎn)生異物反應后,內(nèi)膜開始增生,隨后造成管腔急劇狹窄,最終閉塞,使后肢呈持續(xù)缺血狀態(tài)。3.2慢性心肌缺血對大鼠肢體側支血管數(shù)、形態(tài)變化的影響慢性缺血組患側股四頭肌在術后第7天小動脈密度小于急性缺血組,由此提示,線栓股動脈后,小動脈的開放明顯少于急性缺血組。DSA結果顯示:①急性缺血組患側肢體遠端無主干血管顯影,在術后第7天,股部即出現(xiàn)側支循環(huán)開放,表現(xiàn)為患側側支血管數(shù)量多于健側,在術后第42天達到高峰。②慢性缺血組在術后第7天,所栓塞的血管基本顯影,但存在部分的充盈缺損;在術后第14天仍有部分血管顯影,但造影劑顏色變淡,遠端顯影不佳。側支循環(huán)血管計數(shù)結果顯示:在術后第7天慢性缺血組未見明顯的側支血管開放,第14天側支血管增加,在術后第42天,患側肢體側支血管數(shù)仍高于健側。分析其原因為:急性動脈閉塞使得肢體缺血區(qū)域與非缺血區(qū)域血流的壓力差(血管剪切力)突然增加,從而導致了側支血管可以在短時間內(nèi)大量開放。同時,這種血管剪切力的增加也可導致相應基因的表達。然而,慢性肢體缺血不會突然增加血管剪切力,故側支血管不會在短時間內(nèi)開放,因而導致下肢的血流呈緩慢的恢復狀態(tài)。故如何減少血管剪切力的突然增加是制備慢性缺血模型的關鍵之一。另外,本實驗還觀察到肢體發(fā)生急性缺血后,相應組織的炎性細胞浸潤明顯增加。炎性細胞中的單核細胞和巨噬細胞通過在局部釋放如單核細胞趨化蛋白-1(monocytechemotacticproten-1,MCP-1)等多種細胞因子,在血管新生中起著重要的作用。故如何抑制缺血后局部的炎性細胞浸潤也是能否成功制備慢性缺血模型的關鍵之一。綜合本實驗結果及其分析,通過線栓大鼠股動脈的方法可維持大鼠后肢缺血狀態(tài)6~7周以上,而且較少表現(xiàn)出肌肉的急性壞死。該手術操作簡單,組織的病理學改變及形成缺血的過程更接近臨床慢性下肢缺血過程。在今后進一步的研究中如何避免血管剪切力和炎性細胞浸潤是成功制備慢性缺血動物模型的重點。1.3.2股動脈活檢麻醉方法及切口位置同上,于腹股溝根部分離出股動脈和股靜脈。分別于股動脈近、遠端阻斷股動脈及股