丙泊酚對(duì)新生小鼠大腦梨狀皮層中間神經(jīng)元的影響及相關(guān)作用研究研究背景:丙泊酚(Propofol)是一種短效的、新型快速的全身麻醉藥物,因其起效迅速、作用時(shí)間短、蘇醒快、術(shù)后惡心嘔吐發(fā)生率低而被廣泛應(yīng)用于臨床麻醉及ICU鎮(zhèn)靜。近年來,麻醉藥物對(duì)發(fā)育大腦認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶的影響是大家關(guān)注的熱點(diǎn)問題。臨床研究結(jié)果表明,兩歲以下嬰幼兒全麻藥物暴露可致較長(zhǎng)時(shí)間的人格及行為改變。然而,全麻藥物丙泊酚所致神經(jīng)毒性的機(jī)制仍不明確。大腦梨狀皮層(Piriformcortex)位于前腦腹外側(cè),源于古皮質(zhì),屬邊緣系統(tǒng),是哺乳動(dòng)物最大的嗅覺皮層,接受嗅球的單突觸輸入,且與相關(guān)皮層及海馬間存在復(fù)雜的纖維投射。梨狀皮層由三層皮質(zhì)組成,第一層稱為網(wǎng)織層,主要接受外側(cè)嗅束的投射纖維,第二、三層稱為細(xì)胞層,主要接收外側(cè)嗅束、相鄰皮層的興奮輸入及局部中間神經(jīng)元的抑制傳入。發(fā)育期大腦梨狀皮層神經(jīng)前體細(xì)胞具有增殖及分化發(fā)育為成熟神經(jīng)元的能力,該皮層同海馬及室管膜下區(qū)一樣存在神經(jīng)發(fā)生的潛能。此外,梨狀皮層的細(xì)胞層主要由數(shù)量較多的釋放谷氨酸的椎體神經(jīng)元及數(shù)量較少釋放γ-氨基丁酸的中間神經(jīng)元組成。梨狀皮層的中間神經(jīng)元按其細(xì)胞表面標(biāo)記物主要分為鈣結(jié)合蛋白(PV—Parvalbumin、CB—Calbindin、CR—Calretinin)中間神經(jīng)元和神經(jīng)肽(SOM—Somatostatin、NPY—NeuropeptideY、CCK—Cholecystokinin)中間神經(jīng)元兩大類。該皮層內(nèi)上述中間神經(jīng)元的功能頗為復(fù)雜,涉及樹突的傳入、軸突的輸出以及各中間神經(jīng)元的遠(yuǎn)程聯(lián)接。正是因?yàn)閷?duì)信息傳入、輸出的調(diào)控,該區(qū)域內(nèi)的中間神經(jīng)元在嗅覺的學(xué)習(xí)、記憶過程中起重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn),對(duì)阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)患者而言,其嗅覺損害癥狀早于認(rèn)知障礙的發(fā)生,并且其大腦梨狀皮層SOM及CR中間神經(jīng)元與AD病理性標(biāo)記物β-淀粉樣蛋白(Amyloidβ,Aβ)及Tau蛋白之間存在共同標(biāo)記,這提示梨狀皮層中間神經(jīng)元在AD的發(fā)生及發(fā)展中的易損性及其與認(rèn)知障礙的密切相關(guān)性。此外,多項(xiàng)研究證實(shí),尿烷(Urethane)麻醉可導(dǎo)致大腦梨狀皮層選擇性的中間神經(jīng)元損傷,這可能與麻醉所致的認(rèn)知功能損害相關(guān)。換而言之,梨狀皮層可能是麻醉藥物發(fā)揮其神經(jīng)毒性作用新的靶區(qū)。神經(jīng)行為障礙(neurobehavioraldisorders)是由多種與大腦疾病或損傷相關(guān)聯(lián)的行為功能損害組成。神經(jīng)行為學(xué)(neuroethology)則是對(duì)動(dòng)物的行為及神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)制研究的方法,目的是通過動(dòng)物的特殊行為學(xué)改變了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,cns)病變。既往研究表明,新生期吸入麻醉藥七氟烷暴露不僅引發(fā)學(xué)習(xí)認(rèn)知功能受損,還可導(dǎo)致類似自閉癥樣的社交行為學(xué)異常。結(jié)合本課題組前期研究成果:丙泊酚抑制發(fā)育大腦海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的增殖,進(jìn)一步探究丙泊酚對(duì)認(rèn)知相關(guān)行為的影響及其可能的機(jī)制。研究方法:本課題首先采用出生后7天(postnatal7,p7)的新生小鼠進(jìn)行丙泊酚(30mg/kg組及60mg/kg組)或脂肪乳腹腔注射以建立丙泊酚模型,應(yīng)用c-fos免疫組織化學(xué)染色方法篩選丙泊酚對(duì)發(fā)育大腦的激活靶區(qū)及定性該靶區(qū)內(nèi)易損神經(jīng)元的類別;同樣地,采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)丙泊酚激活區(qū)域(梨狀皮層)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖以明確丙泊酚對(duì)發(fā)育大腦梨狀皮層神經(jīng)發(fā)生的影響。此外,建立丙泊酚多次注射模型,即p7-p9連續(xù)注射丙泊酚并飼養(yǎng)至成年以觀察發(fā)育期丙泊酚暴露對(duì)遠(yuǎn)期神經(jīng)行為的影響。采用食物埋藏實(shí)驗(yàn)(buriedfoodtest)檢測(cè)丙泊酚模型小鼠與對(duì)照組小鼠的嗅覺識(shí)別及嗅覺學(xué)習(xí)記憶功能;采用社交實(shí)驗(yàn)(sociabilityandpreferencefornoveltytest)檢測(cè)丙泊酚模型小鼠與對(duì)照組小鼠的社會(huì)行為及社會(huì)偏好;采用新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)(novelobjectrecognitiontest)檢測(cè)丙泊酚模型小鼠與對(duì)照組小鼠的認(rèn)知記憶功能。最后,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)p21小鼠大腦梨狀皮層易損神經(jīng)元的改變以探討丙泊酚影響發(fā)育大腦神經(jīng)行為可能的機(jī)制。研究結(jié)果:1、丙泊酚激活發(fā)育大腦梨狀皮層中間神經(jīng)元(1)c-fos免疫組織化學(xué)結(jié)果表明:與脂肪乳對(duì)照組小鼠相比,丙泊酚30mg/kg組(p<0.05)及丙泊酚60mg/kg組(p<0.05)小鼠大腦梨狀皮層c-fos+細(xì)胞均顯著增多。(2)c-fos與neun及gfap雙重標(biāo)記免疫組織化學(xué)結(jié)果表明:三組間,neun標(biāo)記的成熟神經(jīng)元數(shù)量無差異;丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組與脂肪乳對(duì)照組相比c-fos與neun雙重標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)量均顯著增多(p<0.05);然而,c-fos與gfap無共標(biāo)陽性細(xì)胞。(3)c-fos與cb、cr、som、npy雙重標(biāo)記免疫組織化學(xué)結(jié)果表明:丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組與脂肪乳對(duì)照組相比c-fos與cb雙重標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)量均顯著增多(p<0.01);然而,c-fos與cr中神經(jīng)元及神經(jīng)肽類中間神經(jīng)元標(biāo)記物som、npy之間幾乎沒有共標(biāo)陽性細(xì)胞。2、丙泊酚對(duì)發(fā)育大腦梨狀皮層神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的影響(1)brdu免疫組織化學(xué)結(jié)果表明:與脂肪乳對(duì)照組小鼠相比,丙泊酚30mg/kg組(p<0.05)及丙泊酚60mg/kg組(p<0.01)小鼠大腦梨狀皮層brdu+細(xì)胞均顯著減少;且與丙泊酚30mg/kg組相比,丙泊酚60mg/kg組小鼠大腦梨狀皮層brdu+細(xì)胞減少更為顯著(p<0.05)。(2)sox2與brdu雙重標(biāo)記免疫組織化學(xué)結(jié)果表明:與脂肪乳對(duì)照組小鼠相比,丙泊酚30mg/kg組小鼠大腦梨狀皮層sox2+細(xì)胞無顯著差異,丙泊酚60mg/kg組小鼠大腦梨狀皮層sox2+細(xì)胞則減少顯著(p<0.01)。同樣地,brdu-sox2雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)量丙泊酚30mg/kg組與脂肪乳對(duì)照組相比,改變無顯著差異,而丙泊酚60mg/kg組則顯著減少(p<0.01)。(3)nestin免疫組織化學(xué)結(jié)果表明:與脂肪乳對(duì)照組小鼠相比,丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組小鼠大腦梨狀皮層nestin標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞纖維突起分布稀疏且排列紊亂(p<0.01)。3、發(fā)育期丙泊酚麻醉暴露對(duì)成年期神經(jīng)行為學(xué)的影響及可能機(jī)制(1)食物埋藏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:丙泊酚30mg/kg組小鼠與對(duì)照組小鼠相比探索埋藏食物的潛伏期無明顯改變,然而丙泊酚60mg/kg組小鼠與對(duì)照組及丙泊酚30mg/kg組小鼠相比,探索埋藏食物的潛伏期則明顯增加(p<0.01,p<0.05)。(2)社交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:對(duì)照組小鼠較喜歡呆在有小鼠的一側(cè)箱體(p<0.05),而丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組小鼠在兩側(cè)箱體的時(shí)間則無差異;在該實(shí)驗(yàn)的第二階段即社會(huì)新奇偏好性測(cè)試中,對(duì)照組小鼠較偏好與陌生小鼠交流(p<0.01),而丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組小鼠則未有如此表現(xiàn)。(3)新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:對(duì)照組小鼠新物體的探索時(shí)間較舊物體探索時(shí)間明顯增多(p<0.001),而丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組小鼠則無明顯偏好性。換言之,丙泊酚30mg/kg組及丙泊酚60mg/kg組小鼠較對(duì)照組小鼠新物體分辨率明顯下降(p<0.001)。(4)p21小鼠大腦切片免