PAGE62目錄目錄 i中文摘要 iAbstract ii第一章文獻綜述 11.1引言 11.2單寧酶的性質(zhì) 21.2.1單寧酶的理化性質(zhì) 21.2.2單寧酶的酶學(xué)性質(zhì) 21.3單寧酶分離純化及菌株篩選 31.4單寧酶的酶活力測定 41.5單寧酶的固定化 51.5.1固定化酶的方法和特性 51.5.2單寧酶的固定化 51.6單寧酶的應(yīng)用 61.6.1應(yīng)用于食品工業(yè) 61.6.2制革工業(yè) 71.6.3飼料工業(yè) 71.6.4化妝品工業(yè) 71.6.5精細化工與制藥工業(yè) 71.7本課題立題意義和研究內(nèi)容 81.7.1本課題的立題意義 81.7.2本課題的研究內(nèi)容 8第二章產(chǎn)單寧酶黑曲霉菌株的誘變及篩選 102.1前言 102.2材料與設(shè)備 102.2.1菌種 102.2.2培養(yǎng)基 102.2.3實驗儀器 112.3實驗方法 122.3.1實驗菌種的培養(yǎng)及初步鑒定 122.3.2出發(fā)菌株的篩選 122.3.3紫外誘變 132.3.4復(fù)篩方法 132.3.5粗酶液的提取 132.3.6酶活測定方法 132.3.7單寧酶高活性菌株的產(chǎn)酶穩(wěn)定性 132.4實驗結(jié)果與討論 142.4.1實驗菌種的初步鑒定 142.4.2出發(fā)菌株的篩選 142.4.3紫外誘變篩選單寧酶高活性菌株 15PAGE622.4.4單寧酶高活性菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性 162.5本章小結(jié) 17第三章單寧酶活力測定方法的構(gòu)建 183.1前言 183.2實驗材料與方法 183.2.1菌種 183.2.2培養(yǎng)基 193.2.4試劑 193.2.5儀器 193.2.5實驗方法 193.3實驗結(jié)果與討論 213.3.1沒食子酸吸收峰波長 213.3.2沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程 223.3.3單寧酶活力測定 233.3.4單寧酶活力測定方法比較 233.4本章小結(jié) 24第四章固體發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)單寧酶研究 264.1前言 264.2實驗材料與方法 264.2.1菌種 264.2.2培養(yǎng)基 264.2.3試劑 274.2.4儀器 274.2.5實驗方法 274.3實驗結(jié)果與討論 304.3.1液體發(fā)酵法與固體發(fā)酵法的比較 304.3.2黑曲霉產(chǎn)單寧酶固體發(fā)酵單因素條件研究 314.3.3響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 354.4單寧酶產(chǎn)酶活力曲線 394.5結(jié)論 40第五章單寧酶的固定化 415.1前言 415.2實驗材料 415.2.1菌種 415.2.2試劑 425.2.3儀器 425.3實驗方法 425.3.1單寧酶粗酶液的提取 425.3.2單寧酶酶活測定 425.3.3以海藻酸鈉為載體固定化單寧酶固定化方法的選擇 425.3.4固定化單寧酶條件的優(yōu)化 435.3.5固定化酶性質(zhì)的研究 445.4實驗結(jié)果與討論 455.4.1海藻酸鈉為載體固定化單寧酶固定化方法的選擇 45PAGE625.4.2固定化單寧酶的條件研究 455.4.3固定化酶的最適溫度 495.4.4固定化酶的熱穩(wěn)定性 505.4.5固定化酶的最適ph 505.4.6固定化酶的貯藏穩(wěn)定性 515.5本章小結(jié) 51第六章結(jié)論與展望 526.1結(jié)論 526.2展望 53參考文獻 54PAGE62中文摘要單寧酶全稱是單寧酯酰水解酶（Tannase,EC0），它可以水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖。單寧酶用途廣泛，主要來源于微生物，目前研究得較多較為深入的是青霉和黑曲霉。本論文利用紫外誘變的方法選育到一株產(chǎn)單寧酶的黑曲霉菌株，對該菌株固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的發(fā)酵工藝條件及發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，研究確立了固體發(fā)酵所產(chǎn)單寧酶的酶活檢測方法，論文還對產(chǎn)單寧酶的黑曲霉菌株發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的固定化進行了研究。PAGE\#"'頁：'#'

'"本研究采用紫外誘變的菌種選育手段進行黑曲霉菌株的誘變，用在平板培養(yǎng)基中加入微量的的溴酚藍（0.004%），利用黑曲霉生長形成的變色圈大小對菌株進行篩選，成功的選育到了一株產(chǎn)單寧酶達92U/mL的黑曲霉高產(chǎn)菌株。它的單寧酶活性較原始出發(fā)菌株提高了1倍多。PAGE\#"'頁：'#'

'"論文首先研究和建立了適合固體發(fā)酵所產(chǎn)胞外單寧酶活性的檢測方法。此方法是根據(jù)沒食子酸（單寧酶催化沒食子酸丙酯水解產(chǎn)生）與甲醇繞丹寧之間形成色團物質(zhì)的方法來測定單寧酶的活性，沒食子酸丙酯做底物顯色明顯，選擇520nm波長下檢測，成功的避開了干擾物質(zhì)的吸收峰波長，減小了誤差，該方法對底物純度要求低，常規(guī)實驗室的儀器就能進行檢測，具有簡便直觀、靈敏準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點。PAGE\#"'頁：'#'

'"對選育的產(chǎn)單寧酶黑曲霉菌株進行固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶研究，結(jié)果表明產(chǎn)單寧酶的最適氮源為NH4NO3，對發(fā)酵培養(yǎng)基進行單因素優(yōu)化結(jié)果表明：每5g培養(yǎng)基基質(zhì)含1％NH4NO3；0.1％NaCl；0.1％MgSO4；8％五倍子；90%麩皮。對發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化后得到：初始水分含量50％，初始ph6.0，溫度300C為最佳產(chǎn)酶條件。利用響應(yīng)面方法對顯著影響產(chǎn)單寧酶的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件因素進行優(yōu)化，得到固體發(fā)酵黑曲霉誘變株最佳產(chǎn)單寧酶酶條件為：五倍子含量為9.5％；氮源NH4NO3添加量為2.3%；溫度為320C。在此最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵產(chǎn)單寧酶達219.4U/PAGE\#"'頁：'#'

'"對發(fā)酵產(chǎn)單寧酶進行固定化研究，以海藻酸鈉為固定化單寧酶的載體，采用交聯(lián)-包埋-交聯(lián)的方法對單寧酶進行固定化。對前交聯(lián)戊二醛濃度，前交聯(lián)時間、溫度，海藻酸鈉濃度，CaCl2濃度，硬化時間，后交聯(lián)戊二醛濃度，后交聯(lián)時間、溫度等固定化工藝進行研究，對固定化單寧酶的性質(zhì)進行了初步研究。關(guān)鍵詞：單寧酶黑曲霉固體發(fā)酵單寧酶固定化PAGE62AbstractThefullnameofTannaseisthetanninesteracidradicalhydroltyicenzyme(Tannase,theEC0),bywhichesterkeyandshrinkphenolcarboxylickeyofthegallicacidtannincouldbehydrolyzedintothegallicacidandtheglucose.TheTannasemainlyproducedbymicrobiologywasusedwidely,existinginandoutsidethecell.AtpresentthePenicilliumandtheAspergillusnigerarestudiedmorethanothers.AnAspergillusnigerstrainproducingtannasehighlywasselectedbyultravioletmutafacientmethodinthispaper.Measurementabouttheactivityoftannaseinthesolidfermentwasstudiedandestablilshed.OptimizationoffermentationconditionandtheculturemediumwascarriedoninthisAspergillusnigerstrainproducingtannasehighlythroughsolidferment,bywhichenzymeactivitywasincreased.Finallyimmobilityoftannasewasalsostudied.Effectivelyinitialsievemethodwasusedinthisstudyasfollow.Thetinytetrabromophenolsulfonphthalein(0.004%)wasaddedintothedullculturemedium,Aspergillusnigerstrainwasinducedbyultraviolettoselectonestrainhighlyproducingtannase92U/mLsuccessfullyaftertheinitialselectionofstrainswithcolor-changingloopbygrowingofAspergillusnigerwhoseactivityoftannaseenhancedmorethan1time.Thisrebuildingmeasurementoftannaseactivitywassimple,sensitive,directandgoodatduplication.Thisexaminationofactivityoftannaseproducedthroughthesolidfermentationoutsideofthecellhadthecharacterofhigheffectivityandaccuracy.Examinationperformedunderthe520nmwavelengthhadsuccessfullyavoidedwavelengthofabsorptionpeakofthedisturbancematerialtoreducetheerror.Thesetofcontroltubeandblanktubecouldeliminateinfluenceofthegallicacidandthetannicacidinthethickenzymefluid.Thegallicacidpropylesterasthesubstratecoloredobviously,whichwasrequestedlowlyinthepurityofsubstratesothattheconventionalinstrumentinthelaboratorycancarryontheexamination.ThroughthestudyoftannaseproducedbysievedAspergillusniger,theresultindicatedthatthemostsuitablenitrogensourceoftannasewasNH4NO3,andeach5gculturemediummatrixcontains1%NH4NO3;0.1%NaCl;0.1%MgSO4;8%gallnuts;bran.theinitialmoisturecontent50%,initialPH6.0,300℃inthetemperatureasthebestconditionweregainedbythePAGE62optimizationofthesinglefactoroffermentcondition,andtheactivityoftannasecouldbeenhancedhighlybyadding8%gallnutsintomedium.Thusweknewthatthebestconditionofproducingtannasebysolidfermentationwas9.5%gallnutcontent;2.3%nitrogensourcerecruitment;320Cinthetemperature.Theactivityoftannasewas219.4U/mLbytheconfirmationexperimentaccordingtothebestfermentationcondition.Theseaalginicacidsodiumhadbeenchoseasthecarrieroftheimmobilityoftannasebythemethodoflinking-embedding-crossinglinking.Westudiedinfluenceofreturns-rationoftannaseactivitybythedensityoftheglutaricdialdehyde,thetime,thetemperature,densityoftheseaalginicacidsodium,thecacldensityandthefirmtimebeforethecrosseslinkinganddensityoftheglutaricdialdehyde,timeandtemperatureafterthecrosseslinking.Finallywestudiedpartlythenatureoftannaseimmobilized.Keywords:tannaseAspergillusnigersolidfermentationimmobilityoftannasePAGE62第一章文獻綜述1.1引言單寧酶全稱是單寧酯酰水解酶（Tannase,EC0），它可以水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖。單寧酶在自然界中分布相當(dāng)廣泛，較早的有關(guān)單寧酶的報道可以追溯到上世紀二十年代，F(xiàn)reudenberg［1］在進行黑曲霉培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)在其菌絲中含有單寧酶，以后又發(fā)現(xiàn)各類微生物，包括真菌、酵母、細菌都能產(chǎn)生單寧酶；單寧酶還存在于一些植物材料中，例如茶葉提取物。單寧酶不僅分布廣，而且用途也較多，但單寧酶的研究開始都圍繞著茶葉加工業(yè)展開，日本和美國在這方面的研究開展較早，并取得了很多成果。我國20世紀90年代才開始了單寧酶的研究，由于單寧酶的應(yīng)用日趨廣泛，因此對單寧酶的深入研究變得十分迫切。單寧酶用途廣泛，但是由于生產(chǎn)提純過程復(fù)雜、產(chǎn)量很小所以市場價格昂貴。這樣就使單寧酶的應(yīng)用受到限制。單寧酶屬于誘導(dǎo)酶，主要利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種，國內(nèi)對單寧酶發(fā)酵生產(chǎn)主要以液體發(fā)酵研究為主，迄今為止，所有的單寧酶研究和生產(chǎn)中都將單寧酸或含有沒食子單寧的原料作為發(fā)酵培養(yǎng)基中必需的組分。P.K.Lekha和B.K.Lonsne［2］在對黑曲霉DKL104進行液體表層發(fā)酵、液體深層發(fā)酵和固體發(fā)酵比較實驗時發(fā)現(xiàn)，固體發(fā)酵與液體發(fā)酵不同，固體發(fā)酵黑曲霉所產(chǎn)的單寧酶幾乎全部都是胞外酶，而且比液體發(fā)酵在縮短一半的培養(yǎng)時間的同時，酶產(chǎn)量可分別提高1.8倍和2.5倍，固體發(fā)酵方法較液體發(fā)酵法有許多優(yōu)越性。而國內(nèi)絕大多數(shù)研究者采用液體發(fā)酵法研究單寧酶的生產(chǎn)，所得到的胞內(nèi)單寧酶活性都較低。國外有一些固體發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶的研究報道，A.Sabu［3］等利用羅望子果實棕櫚果仁作為培養(yǎng)基基礎(chǔ)，進行固體發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)單寧酶的研究，得到單寧酶的酶活力最高為12.7U/g干基。B.Trevino-Cueto［4］等用富含單寧酸的沙漠植物作為培養(yǎng)基基礎(chǔ)對黑曲霉進行固體發(fā)酵，所得到的酶活力為9.2U/g干基?？v觀近50年來單寧酶研究領(lǐng)域中的相關(guān)文獻報道，單寧酶研究的發(fā)展趨勢主要為:(1)采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建出高產(chǎn)單寧酶基因工程菌，為單寧酶的工業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模應(yīng)用提供優(yōu)良的菌種。(2)進一步完善產(chǎn)單寧酶發(fā)酵工藝，提高酶生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。(3)嘗試構(gòu)建出更為適合工業(yè)化的單寧酶提純技術(shù)，進一步降低酶生產(chǎn)的成本。(4)在單寧酶的應(yīng)用中，采用固定化酶技術(shù)甚至是固定化細胞技術(shù)來克服游離酶自身的缺陷，滿足單寧酶在各工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用需求。(5)PAGE62在單寧酶原有應(yīng)用領(lǐng)域的基礎(chǔ)上，開拓其在其它更廣泛領(lǐng)域中的應(yīng)用前景，充分發(fā)揮其潛在的應(yīng)用價值。1.2單寧酶的性質(zhì)1.2.1單寧酶的理化性質(zhì)純單寧酶在紫外光區(qū)280nm處,有一個最大吸收峰,在濃度為10%,比色皿為1cm×1cm條件下,吸光系數(shù)a為11.8,260nm處吸光度與280nm處吸光度之比為0.51［5］，SadaakiIibuchi［6］,ChaeSoo-Kyu［7］分別用凝膠過濾法測定出它們各自選育的菌種單寧酶相對分子質(zhì)量都為200000。OsaoAdachi［5］等分別用沉降法和電泳法測定黃曲霉單寧酶相對分子質(zhì)量,分別是194,000和192,000。BarthomeufC.[8]等測出黑曲霉LCF8單寧酶相對分子質(zhì)量為186,000,其等電點在4左右。BarthomeufC.和ChaeSoo-Kyu等在對各自提純的酶進行SDS2聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時發(fā)現(xiàn),單寧酶分子由2種亞基組成,但這個結(jié)果與KenjiAoki［9］對酵母單寧酶結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果有所不同。后者用同樣的方法,只得到一條電泳蛋白帶。1.2.2單寧酶的酶學(xué)性質(zhì)多數(shù)菌株單寧酶的活性ph穩(wěn)定范圍都在3.0～8.0之間，最適ph值為4.0～6.0，熱穩(wěn)定范圍在60～70℃以下，最適溫度為30～60℃。YamadaH.等(1968)報道的黃曲霉單寧酶活性的ph穩(wěn)定范圍最窄，為5.0～5.5.ChaeSoo-Kyu等[7](1983)報道的曲霉AN-11菌株所產(chǎn)單寧酶活性的ph穩(wěn)定范圍為5.0～6.5。來源于不同菌株的單寧酶動力學(xué)性質(zhì)稍有區(qū)別。YamadaH.等[10](1968)就底物濃度對黃曲霉單寧酶的影響進行研究，測出Km(以單寧酸為底物)為0.5×10－4mol/L;Km(以葡萄糖一1一沒食子酸為底物)為1.4×10－4mo1/L;Km(以沒食子酸甲酯為底物)為8.6×10－4mo1/L。RajakumarG.S.等［11](1983)測得產(chǎn)黃青霉所產(chǎn)的單寧酶以單寧酸為底物時，其Km為0.48×10－4mol/L。FariasG.M.等[12](1994)測得Cryphonectriaparasitica所產(chǎn)的單寧酶以單寧酸為底物時，其Km為0.95×10－3mol/L；以栗木單寧為底物時，其Km為5.07×10－3mol/L；而以沒食子酸為底物時，其Km高達11.0～13.1×10－3mol/L，故沒食子酸是單寧酶底物中最具競爭性抑制的底物之一。由此他們得出結(jié)論，單寧酶對特定的單寧底物的相對酶活可能是與該底物中酯鍵和縮酚羧鍵的數(shù)量有關(guān)。SharmaShweta.等[13](1999)測得黑曲霉所產(chǎn)的單寧酶的Km為0.2×10－3mol/L.有關(guān)各種金屬離子以及EDTA對單寧酶活性影響的報道結(jié)論不一。KenjiAoki等[9](1976)研究表明ZnC12,CuS04,CoCl2和NiS04等不同的金屬離子對單寧酶酶活力無影響，而EDTA對酶活力影響不明顯。相反，RajakumarG.S.等[11](1983)研究表明Cu2+,Zn2+,Fe2+甚至是Mg2+等不同的金屬離子均對單寧酶酶活力有著顯著的抑制效應(yīng)。同樣，SadaakiPAGE62libuchi等[6](1968)研究表明任何金屬鹽均不能激活單寧酶，ZnC12和CuCl2:則會抑制酶活力或使酶失活。此外，EDTA溶液也會使單寧酶完全失活。郭魯宏等[14](1999)研究發(fā)現(xiàn)除了Mn2+和Fe2+抑制單寧酶酶活之外，其它金屬離子則對酶活均無明顯的激活作用或抑制作用。1.3單寧酶分離純化及菌株篩選單寧酶主要是由微生物生產(chǎn)的，能夠產(chǎn)生單寧酶的菌種十分豐富，除了傳統(tǒng)的青霉、曲霉、酵母，還有巴斯德菌、寄生內(nèi)座殼菌、綠色木霉和茄形鐮刀菌等，單寧酶既存在于細胞內(nèi)，又存在于細胞外。但是目前研究得較多較為深入的還是青霉和曲霉。1977年S.Bradoo等［15］建立了一種利用平板篩選單寧酶的方法。其平板培養(yǎng)基由1%的單寧加上3%的瓊脂，將要篩選的菌種點種在平板上適宜溫度下培養(yǎng)48h，以菌落周圍的透明圈直徑與菌落直徑的比值為篩選標(biāo)志。郭魯宏等［16］在此基礎(chǔ)上對培養(yǎng)基作了一些改進，在培養(yǎng)基中加入了溴酚藍。由于五倍子單寧被分解成沒食子酸，培養(yǎng)基的ph值由4.5左右降為3左右，這與溴酚藍的變色范圍基本一致，因此培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色，而且少量的溴酚藍（0.004％）不會對黑曲霉的生長及單寧酶活性造成不利影響，用這樣的培養(yǎng)基進行初篩非常直觀，而且準(zhǔn)確高效。單寧酶既存在于細胞內(nèi)，又存在于細胞外，通常發(fā)酵液中的單寧酶，一般采用硫酸銨鹽析或加入丙酮、乙醇等有機溶劑使之沉淀，然后過濾，得到粗酶。Libuchi等［17］在發(fā)酵液中加入硫酸銨達到0.8飽和度，放置15小時后，用加有助濾劑硅藻土535的漏斗過濾，再將沉淀溶于水中，離心后得到粗單寧酶液，進一步用DEAE－SephadexA50離子交換，SephadexG-100凝膠過濾，獲得了純化的單寧酶，并進行了性質(zhì)研究。Parthasarathy等［18］用SephadexG－200凝膠過濾，再用DEAE－SephadexA25柱作離子交換層析純化粗單寧酶。Aoki等［19］使用Ecteola-纖維素、Sepharose6B和SephadexG－200純化假絲酵母單寧酶。王征等［20］采用40％的硫酸銨和80％硫酸銨兩部鹽析法沉淀單寧酶，經(jīng)過透析，DEAE－纖維素陰離子交換層析，SephadexG－150柱層析，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，單寧酶達到電泳純，經(jīng)過上述酶純化過程，提純倍數(shù)達到115，酶回收率為21％。單寧酶的提純技術(shù)正在從復(fù)雜的實驗室提純向工業(yè)化生產(chǎn)過渡。對于菌絲體中的單寧酶要先進行細胞破壁，研究者們探索了很多細胞破壁的方法，有利用超聲波、石英砂研磨、滲透壓法等經(jīng)典方法破壁的，也有研究者探索一些新的酶得率更高的方法，如法國學(xué)者利用凍融法，再加入伴刀豆球蛋白（凝集素）破壁［21］，效果不錯。PAGE621.4單寧酶的酶活力測定單寧酶的活力檢測一般用單寧酸來作為酶活力測定底物，其基本原理是單寧酸在310nm處的吸光值可因酶促反應(yīng)的發(fā)生而改變，這樣就可根據(jù)改變量計算酶活。但用單寧酸作為底物的不足之處是底物單寧酸對產(chǎn)物沒食子酸的光吸收有很大的干擾?，F(xiàn)在有些研究者已嘗試用別的底物替代單寧酸。研究人員為了滿足各自研究的需要，選用不同的底物、不同的測定參數(shù)，以底物的減少或產(chǎn)物的增加甚至是ph值改變等作為測定對象，構(gòu)建出各具特色的單寧酶酶活力測定方法。這些測定方法大致歸類為滴定法、紫外分光光度法、比色法和高效液相色譜法等。(1)紫外分光光度法。SadaakiIibuchi等［22］于1967年建立了紫外分光光度法,基本原理是根據(jù)底物單寧在310nm處吸光度的變化求酶活力。大多數(shù)研究者都采用這個方法，此法簡單快捷,且誤差在1%～3%之間,但此法底物對產(chǎn)物沒食子酸的光吸收有很大的干擾，對底物單寧純度要求非常高。也有研究者嘗試用其他底物來替代單寧，如甲基沒食子酸,沒食子酸丙酯。如王征等［23］采用了沒食子酸丙酯（PG）作為單寧酶底物，取得了較好的效果。這種底物濃度允許范圍較廣，有利于酶活力的測定。并且在270nm波長下底物PG的濃度變化可通過吸收值的明顯變化而被靈敏的測定出來，避免了產(chǎn)物沒食子酸光吸收的干擾。(2)滴定法。由于單寧在單寧酶作用下分解生成游離的沒食子酸,可用堿對之進行滴定,確定底物單寧的減少量而測得酶活力.但是,因為緩沖液對堿的緩沖力以及單寧本身的褐色干擾了滴定終點,再者,隨溶液ph值增高,單寧會逐漸發(fā)生水解,將影響測定結(jié)果的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性［22］。(3)視讀法。澳大利亞科學(xué)家OsaweR［24］于1993年,建立了細菌單寧酶活力測定方法,其根據(jù)有兩點:①單寧可水解生成游離的沒食子酸；②沒食子酸在空氣中暴露被氧化，顏色從綠色變成褐色.通過比色求其變化量而測得酶活力。(4)高效液相色譜法。1994年,法國的ChantalBarthomeuf等［25］用高效液相色譜法連續(xù)測定反應(yīng)過程中產(chǎn)物沒食子酸變化量,直接測定出酶反應(yīng)的初速度,此法迅速準(zhǔn)確,但對儀器要求較高.(5)氣相色譜法。1981年Jean.D[26]等以沒食子酸甲酯為底物，采用氣相色譜法連續(xù)測定酶促反應(yīng)過程中沒食子酸的變化量直接求出酶促反應(yīng)的初速度，該方法準(zhǔn)確，但操作繁瑣且實驗儀器要求很高，為非常規(guī)測定方法。PAGE621.5單寧酶的固定化1.5.1固定化酶的方法和特性固定化酶的制備方法分為四類：吸附法、包埋法、共價結(jié)合法和交聯(lián)法。吸附法分為物理吸附法和離子吸附法[27]。酶被載體吸而固定化的方法稱為物理吸附法。離子吸附法是將酶與含有離子交換基團的水不溶性載體以靜電作用力相結(jié)合的固定化方法。包埋法可分為網(wǎng)格型和微囊型兩種。前者是將酶包埋于高分子凝膠細微網(wǎng)格內(nèi)；而后者是將酶包埋在高分子半透膜中制備成微囊型。共價結(jié)合法是將酶與水不溶性載體以共價鍵結(jié)合的方法，此法研究較為成熟。交聯(lián)法是用雙功能試劑或多功能試劑進行酶分子之間的交聯(lián)，是酶分子和雙功能試劑或多功能試劑之間形成共價鍵，得到三向的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，除了酶分子之間發(fā)生交聯(lián)外，還存在一定的分子內(nèi)交聯(lián)。酶經(jīng)固定化后，活力大部分下降，這是因為：①酶活性部位的重要氨基酸與水不溶性載體相結(jié)合；②當(dāng)酶與水不溶性載體相結(jié)合時，它的結(jié)構(gòu)起了變化；③酶被固定化后，酶與底物的相互作用受到空間位阻的影響。固定化酶的穩(wěn)定性一般要比游離酶提高很多，有利于工業(yè)生產(chǎn)。熱穩(wěn)定性對工業(yè)應(yīng)用極為重要。多數(shù)固定化酶的酸堿穩(wěn)定性高于游離酶，這體現(xiàn)在其反應(yīng)最適ph范圍變寬。固定化酶在操作中可以長時間保留活力，半衰期在一個月以上即有工業(yè)應(yīng)用價值。1.5.2單寧酶的固定化單寧酶能夠水解單寧的酯鍵，生成沒食子酸和葡萄糖，沒食子酸可以作為醫(yī)藥中間體，又可作為食品、化妝品及飼料的抗氧化劑，近年來還用作感光樹脂的原料，應(yīng)用廣泛。單寧酶價格昂貴、使用壽命較短，其應(yīng)用受到一定限制，固定化單寧酶既能保持酶的活性，專一性強，又具有可反復(fù)使用、貯藏性好、ph值與溫度范圍寬的特點，因此研究者對單寧酶進行固定化研究。WeetallH.H.等［28］對單寧酶的固定化進行了探索,將單寧酶用一定孔徑的多孔玻璃珠固定,同時,他還對固定化的單寧酶的ph范圍、熱穩(wěn)定性及半衰期進行了研究。程琦［29］用自制的殼聚糖固定單寧酶,測定固定化單寧酶表觀Km值(以沒食子酸丙酯為底物)、最適ph值以及穩(wěn)定活性ph范圍,并將之應(yīng)用于酯型兒茶素水解反應(yīng)中，可水解茶多酚提取物中96%以上的酯型兒茶素，但此項技術(shù)尚未見應(yīng)用于生產(chǎn)的報道。龔加順等［30］PAGE62利用海藻酸鈣包埋固定單寧酶在水相中水解沒食子單寧生產(chǎn)沒食子酸，并利用聚乙烯醇－戊二醛法制備的固定化單寧酶在有機相中生產(chǎn)沒食子酸丙酯。王征等［31］討論了聚陽離子聚2-羥基-N,N-二甲基氯丙胺對固定化酶的影響，ph值對固定化酶的影響及固定化酶的穩(wěn)定性。采用聚陽離子復(fù)合物加固對酶的包埋程度,防止了使用過程中酶的滲漏,可使該酶延長使用壽命并提高穩(wěn)定性。肖琳等［32］人比較幾種固定化載體，確定以殼聚糖為載體，用戊二醛作交聯(lián)劑制得固定化單寧酶，固定化酶活回收率可達73％。單寧酶經(jīng)固定化后熱穩(wěn)定性、ph穩(wěn)定性及最適溫度均有所提高。英國專利報道[33,34]，單寧酶用硅藻土固定(25mg單寧酶/g硅藻土)，在ph5.5,40℃條件下處理“冷后渾”，效果很好?，F(xiàn)在，紐約開發(fā)公司己開始批量生產(chǎn)該固定化單寧酶。日本專利報道，將單寧酶固定在聚砜中空纖維超濾膜上，然后用這種膜將茶汁趁熱過濾，可避免“冷后渾”而得到澄清的茶汁。NicolasP.[35]等報道，將固定化單寧酶應(yīng)用在20～65℃下浸提茶葉，該單寧酶可實現(xiàn)流化床操作。程琦等[29]研究表明，采用殼聚糖來固定單寧酶，龔加順等［30］采用微孔吸附面積大的沸石固定化單寧酶，并應(yīng)用于茶湯中“冷后渾”轉(zhuǎn)溶研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)茶湯濃度為10%,溫度為40℃時，茶湯的澄清度最高可達41.5%，且茶飲料的口感品質(zhì)己有顯著改善和提高。程啟坤[361.6單寧酶的應(yīng)用1.6.1應(yīng)用于食品工業(yè)利用單寧酶防止茶飲料中的“冷后渾”，效果非常好。在液態(tài)茶和速溶茶的生產(chǎn)中，由于茶湯中多酚類、咖啡堿、蛋白質(zhì)等物質(zhì)通過分子間氫鍵與疏水作用形成絡(luò)合物，可在低溫時沉淀，形成所謂的“冷后渾”，需要采取物理、化學(xué)或酶處理法來消除或使其變成可溶物，即“轉(zhuǎn)溶”工藝。單寧酶就是酶法轉(zhuǎn)溶的專一酶。它能斷裂兒茶酚與沒食子酸間的酯鍵，使苦澀味的酯型兒茶素水解，釋放出的沒食子酸陰離子又能與茶黃素、茶紅素競爭咖啡堿，形成分子量較小的水溶性短鏈物質(zhì)，從而降低茶湯的混濁度[37]，渾濁度由80%降至8%。單寧酶在茶飲料業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛深入。單寧酶應(yīng)用于紅茶、綠茶、烏龍茶深加工中，不僅可以提高茶葉品質(zhì)、產(chǎn)量，而且能使茶葉中可溶性金屬元素含量增加。LaurenS.等[38]報道，用單寧酶處理紅茶，茶湯中可溶性鐵、鈣的含量分別增加了23%與15%。若在綠茶加工中使用單寧酶，可使離子鐵和高鐵的含量均提高18%，并部分消除夏春茶的苦澀味，提高茶品質(zhì)。Procter及GambleCo.[39](1985)PAGE62對紅茶進行單寧酶處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)速溶茶完全溶于冷水，而且滋味良好，而無酶處理的茶的固形物和浸提物產(chǎn)量均低于酶處理的茶。單寧酶還可用以輔助茶葉抗氧化劑來對抗食品氧化。MaiJ.[40]等報道用單寧酶處理的紅茶水浸出物抗氧化能力增強。此外，單寧酶可應(yīng)用于啤酒和果汁的澄清、防止果酒和果汁中酚類引起的變質(zhì)、咖啡風(fēng)味的軟飲料生產(chǎn)、麥芽多酚的穩(wěn)定處理、葡萄酒風(fēng)味的改進以及作為測定天然沒食子酸酯類結(jié)構(gòu)的一種靈敏的分析探針[41]。1.6.2制革工業(yè)在皮革生產(chǎn)中，單寧能與動物皮層中的蛋白質(zhì)結(jié)合形成沉淀，從而將生皮鞣制成難以透水、致密而柔軟的革。1.6.3飼料工業(yè)來源于植物的飼料往往含有單寧，它可以使植物蛋白以及家畜自身所分泌的消化酶蛋白凝固沉淀，從而減少家畜對攝入蛋白的消化率和增加糞便排泄中的氮源[42]。因此，在飼料加工過程中如用單寧酶進行相應(yīng)處理，將大大提高家畜對植物蛋白的利用和吸收率，降低畜牧業(yè)的生產(chǎn)成本。1.6.4化妝品工業(yè)由于單寧酶具有水解單寧酸中酯鍵的性質(zhì)，故在化妝品生產(chǎn)中也已得到應(yīng)用。為了適應(yīng)人們回歸大自然的心態(tài)與愛美的追求，許多化妝品公司爭相開發(fā)具備滋養(yǎng)、祛斑、防曬、生發(fā)等多種功效的產(chǎn)品，這些產(chǎn)品普遍加入一些植物提取物。當(dāng)加入某些含有單寧的植物提取液時，會使化妝品出現(xiàn)混濁或者結(jié)塊現(xiàn)象。因此，事先如果用單寧酶對這些植物添加劑進行相應(yīng)處理，那么上述情況就可望避免[43]。1.6.5精細化工與制藥工業(yè)沒食子酸是單寧酸水解產(chǎn)物中的主要化工產(chǎn)品，是食品抗氧化劑沒食子酸丙酯和制藥工業(yè)中甲氧芐胺嘧啶(trimethoprim)化學(xué)合成所必需的一種重要原料[44]，近年來還可用作半導(dǎo)體感光樹脂的原料[45]。目前，沒食子酸大多是由單寧酸經(jīng)硫酸水解而成[46]，其產(chǎn)率約為65%。由于硫酸水解法生產(chǎn)沒食子酸存在著嚴重污染環(huán)境和對設(shè)備損耗大等問題，微生物單寧酶水解法應(yīng)運而生。郭魯宏等[45]采用海藻酸鈣包埋來源于黑曲霉的單寧酶，并將此固定化單寧酶應(yīng)用于制備沒食子酸，3次實驗中沒食子酸產(chǎn)品的平均產(chǎn)率達到61%，與目前工業(yè)生產(chǎn)中所采用的硫酸水解法基本相當(dāng)，具有潛在的工業(yè)開發(fā)價值。同年，KarB等[47]PAGE62在印度當(dāng)?shù)胤蛛x獲得一株單寧酶高產(chǎn)的米根霉菌株，以富含單寧的云實(Caesalpiniadigyna)豆莢粉作為原料，分別進行固體發(fā)酵、深層液體發(fā)酵和改進的固體發(fā)酵，將單寧生物轉(zhuǎn)化成沒食子酸，轉(zhuǎn)化率分別可達30.5%,27.5%和90.9%。沒食子酸酯類是沒食子酸的重要衍生物之一，能促進纖維蛋白和血栓的溶解、擴張血管、增加冠動脈血流量及有效抑制血小板的凝集，廣泛地應(yīng)用于治療心腦血管疾病[48]。同時，沒食子酸酯類還可清除體內(nèi)的氧自由基，對炎癥、病毒性疾病、細菌感染性疾病、胃潰瘍、輻射損傷、過敏及老年性癡呆等均有一定的治療和防治作用[49,50]，在醫(yī)藥領(lǐng)域中具有廣泛而重要的應(yīng)用前景.其中沒食子酸丙酯(propylgallate,PG)表現(xiàn)得尤為突出。PG是FAO/WHO組織批準(zhǔn)的油溶性合成食品抗氧化劑，對人體無任何毒副作用，是國際上通用的食品抗氧化劑[51].PG的醫(yī)藥商品名為“通脈酯”，是治療心腦血管疾病的一類新藥，具有抗血小板聚集、增強纖維蛋白和血栓溶解、擴張血管及增加冠動脈血流量等療效[52,53]。同時它還能清除體內(nèi)氧自由基、預(yù)防乳腺癌，對Lrewis肺癌具有抑制和抗轉(zhuǎn)移作用[54]。1.7本課題立題意義和研究內(nèi)容1.7.1本課題的立題意義單寧酶是一種用途相當(dāng)廣泛由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶類，可用在食品加工業(yè)上，是消除茶葉冷后渾的專一酶類，另外單寧酶還可用在制革業(yè)、精細化工行業(yè)以及制藥行業(yè)等，單寧酶的市場需求量大。但由于利用微生物液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量少，精制提純的過程復(fù)雜，市場售價相當(dāng)昂貴，國產(chǎn)的粗單寧酶每50g售價為750￥，而日本產(chǎn)的精制純單寧酶市場售價高達每2320￥/250mg。我國對單寧酶的研究起步較晚，國內(nèi)還沒有大規(guī)模的單寧酶工業(yè)生產(chǎn)。我國在誘變育種、發(fā)酵、提純、固定化等各個方面的研究都還不太完善，諸多因素制約了單寧酶的生產(chǎn)和應(yīng)用。世界上其他一些國家在單寧酶的研究開發(fā)上遠遠走在我國的前面。通過生物技術(shù)來進行黑曲霉的誘變育種獲得單寧酶高產(chǎn)菌，采用固體發(fā)酵的方法對該菌產(chǎn)單寧酶的條件進行研究，增加酶產(chǎn)量、提高酶活、縮短發(fā)酵時間。采用海藻酸鈉為固定化單寧酶的載體應(yīng)用交聯(lián)-包埋-交聯(lián)法的固定化方法對固體發(fā)酵提取的粗單寧酶液進行固定化，固定化單寧酶使單寧酶溫度、ph最適范圍增大，酶活穩(wěn)定性增加，有利于酶分子抵御外界環(huán)境的變化。本課題的研究為工業(yè)化規(guī)模開發(fā)應(yīng)用單寧酶奠定了理論基礎(chǔ)。1.7.2本課題的研究內(nèi)容本課題通過紫外誘變選育手段篩選到一株單寧酶高產(chǎn)菌，建立了一種快速PAGE62簡便的固體發(fā)酵單寧酶活力檢測手段，解決了固體發(fā)酵產(chǎn)酶酶活難檢測的問題，進行了固體發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)單寧酶的研究，對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行了單因素實驗研究，采用五倍子為誘導(dǎo)物添加于培養(yǎng)基中大大提高了單寧酶的活力，同時采用響應(yīng)面方法優(yōu)化了固體發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件。另外本論文還探索了了固定化單寧酶的方法和條件，利用海藻酸鈉作為載體采用交聯(lián)－包埋－交聯(lián)的方法對固體發(fā)酵提取的粗酶液進行固定化，并對固定化酶的性質(zhì)進行了初步研究。本課題的創(chuàng)新之處體現(xiàn)在兩方面，一方面是建立了一種胞外單寧酶活力檢測方法，解決了胞外單寧酶活難檢測的問題；另一方面進行了利用五倍子固體發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)單寧酶的研究，在固體發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)單寧酶方面國內(nèi)還未見報道。PAGE62第二章產(chǎn)單寧酶黑曲霉菌株的誘變及篩選2.1前言單寧酶主要是由曲霉屬真菌產(chǎn)生，其中以黑曲霉（Aspergillusniger）研究和應(yīng)用得最為廣泛。黑曲霉作為單寧酶的產(chǎn)生菌，國內(nèi)外學(xué)者對其理化特性、菌種選育、菌株生長條件等諸多方面進行了長期大量的研究，但其產(chǎn)酶性能均不甚理想，直接從自然界篩選獲得的野生黑曲霉產(chǎn)酶能力無法滿足實際生產(chǎn)的需要。另外，通過基因克隆菌株大量生產(chǎn)微生物單寧酶的技術(shù)也尚未完善。因此，在產(chǎn)單寧酶的野生黑曲霉菌株的基礎(chǔ)上，采用誘變育種的方法來提高單寧酶活性和產(chǎn)量，不失為一種簡單、快捷、經(jīng)濟的可行方法。誘變育種一般是針對微生物細胞進行的。微生物細胞經(jīng)過物理和化學(xué)方法處理后易發(fā)生突變，尤其對于黑曲霉等絲狀真菌特別適用。我們借鑒郭魯宏有關(guān)紫外誘變選育黑曲霉高產(chǎn)單寧酶的經(jīng)驗，通過設(shè)計特殊篩選培養(yǎng)基，利用紫外誘變方法對黑曲霉產(chǎn)單寧酶菌株進行誘變，旨在選育黑曲霉單寧酶高產(chǎn)菌。2.2材料與設(shè)備2.2.1菌種黑曲霉（Aspergillusniger）菌株由貴州大學(xué)食品實驗室提供2株，貴州大學(xué)真菌資源研究所提供3株。2.2.2培養(yǎng)基單寧酸培養(yǎng)基蔗糖3g；NaNO30.6g；K2HPO40.2g；MgSO4.7H2O0.1g；FeSO40.002g；瓊脂6g；單寧酸5g；自來水200mL初篩平板上述單寧酸培養(yǎng)基中加入0.004％的溴酚蘭?；九囵B(yǎng)基(察氏培養(yǎng)基+2%單寧酸)單寧酸2.0%，蔗糖1.0%，NaN030.3%，K2HP040.1%，KCl0.05%,MgS047H2O0.05%，F(xiàn)eSO40.001%，自然ph值。PAGE62菌種保藏培養(yǎng)基馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基2.2.3實驗儀器實驗所用到的儀器設(shè)備見表2-2。表2-1實驗藥品及相關(guān)信息Tab.2-1Chemicalreagentsandrelatedinformation序號藥品名稱分子式（英文名稱）級別生產(chǎn)單位1氫氧化鈉NaOH(Sodiumhydroxide)分析純成都科龍化工試劑廠2可溶性淀粉(C6H10O5)n(Starchsoluble)分析純天津市瑞金特化學(xué)品有限公司3海砂(Seasand)國藥集團化學(xué)試劑有限公司4檸檬酸C6H8O7.H2O分析純上海化學(xué)試劑總廠經(jīng)貿(mào)5檸檬酸三鈉C6H5Na3O7.2H2O分析純重慶化學(xué)試劑總廠6無水乙醇CH3CHOH分析純成都科龍化工試劑廠7鹽酸HCl分析純重慶川江化學(xué)試劑廠8硫酸H2SO4分析純遵義師范學(xué)院化學(xué)試劑廠9繞丹寧rhodanine分析純上海均創(chuàng)化工有限公司表2-2儀器及相關(guān)信息Tab.2-2Instrumentandrelatedinformation序號儀器名稱規(guī)格型號生產(chǎn)單位1722S分光光度計722S上海精密科學(xué)儀器有限公司2萬用電爐DK－98－=2\*ROMANII天津市泰斯特儀器有限公司3電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱101－1A瀘南電爐烘箱廠4電熱真空干燥箱ZK025B上海實驗儀器有限公司5潔凈工作臺SW-CJ-LFD上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠6離心機AnkeTDL－5上海安亭科學(xué)儀器廠7生化培養(yǎng)箱SPX-250B-Z上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠8立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-50SI上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠9顯微鏡ECLIPSE-E200Nikon公司10電子恒溫水浴鍋DZKW－4上?？莆鲈囼瀮x器廠11循環(huán)水式真空泵SHZ－D(=3\*ROMANIII)鞏義市英峪予華儀器廠12精密增力電動攪拌器FuheJJ-1金壇市富華儀器有限公司13電子天平FA1004上海良平儀器儀表有限公司14精密酸度計PHS－3C上海虹益儀器儀表有限公司15100～500μL微量進樣器100～500μL上海求精生化試劑儀器有限公司161000～5000μL微量進樣器1000～5000μL上海安亭微量進樣器廠17恒溫培養(yǎng)震蕩器ZHWY-111B上海智城分析儀器制造有限公司18霉菌培養(yǎng)箱MJ-160B-II上海躍進醫(yī)療器械廠29紫外-可見分光光度計U2550型上海第三分析儀器廠PAGE6230離心機TDL-40B型上海安亭科學(xué)儀器廠2.3實驗方法2.3.1實驗菌種的培養(yǎng)及初步鑒定將獲得的五株菌分別編號為NO.1、NO.2、NO.3、NO.4、NO.5轉(zhuǎn)接入單寧酸培養(yǎng)基中，進行斜面與平板的培養(yǎng)，培養(yǎng)于300C的恒溫培養(yǎng)箱中72h。2.3.2出發(fā)菌株的篩選配制初篩平板培養(yǎng)基：(見)蔗糖3g；NaNO30.6g；K2HPO40.2g；MgSO4.7H2O0.1g；FeSO40.002g；瓊脂6g；自來水180mL單寧酸5g；自來水20mL（1）與（2）分開滅菌，滅菌后待冷卻到400C左右時將（1）和（2）混合再加入0.008g溴酚藍，倒平板備用。接種待五株菌斜面孢子長成熟后，分別用10mL無菌水刮擦下斜面孢子，制成孢子懸液，吸取0.1mL孢子懸液，稀釋一定倍數(shù)后接種于平板初篩培養(yǎng)基，放置于300把實驗菌的孢子涂在含有溴酚藍的平板培養(yǎng)基上，當(dāng)孢子生長成為菌落時，單寧酸被分解為產(chǎn)物沒食子酸，培養(yǎng)基顏色就由紫色變?yōu)辄S色（見圖2.1），從而在菌株周圍形成明顯的變色圈，變色圈的顏色深淺和圈直徑大小代表形成的沒食子酸含量的高低，及同該菌株的產(chǎn)酶水平呈正相關(guān)，據(jù)此可評估試驗菌單寧酶活性的高低。圖2.1黑曲霉在初篩培養(yǎng)基上生長狀況PAGE622.3.3紫外誘變?nèi)【哂休^高單寧酶活性菌株的斜面，用無菌水將孢子洗下，加入滅過菌且盛有玻璃珠的三角瓶中，振動使孢子充分散開，再用玻璃纖維過濾，制成孢子懸液，并調(diào)整孢子濃度為1×106個／mL左右。在無菌平皿中加入5mL孢子溶液，距離15W紫外燈下20cm處，攪拌照射一定時間，吸取0.1mL孢子溶液進行梯度稀釋，涂平板，300C培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)72h。2.3.4復(fù)篩方法初篩菌株在斜面上傳代2～3次后，接種一環(huán)孢子到裝有50mL復(fù)篩培養(yǎng)基的250mL三角錐瓶中，300C振蕩（120r/min）培養(yǎng)72小時，按照.5粗酶液的提取取100mL發(fā)酵懸浮液，經(jīng)布氏漏斗抽濾得菌絲體，用蒸餾水沖洗菌絲體至ph中性，然后置于0.5Mph5.0的檸檬酸緩沖溶液中漂洗，抽濾除去水分，稱重后放入冰箱中預(yù)冷。后以1：1：5的比例與石英砂、緩沖液一起加入到研缽中，冰浴研磨成漿，5000rpm離心20分鐘后取上清液移入50mL容量瓶中，用抽提酶的緩沖液定容，即得單寧酶粗酶液。2.3.6酶活測定方法按照王征［23］測酶活方法測定酶活力，取4支潔凈的10mL具塞試管,分別設(shè)定為對照平行管與測定平行管。在每支試管中先后各加入1mol/L檸檬酸緩沖液和1mL酶液,40℃下平衡5min,先將4mL99%乙醇加入對照管中,使酶失活。5min后,在4支試管中加入底物PG溶液,40℃保溫,準(zhǔn)確反應(yīng)10min,同法終止測定管的酶促反應(yīng)。從上述4支反應(yīng)管中各取1mL反應(yīng)液,分別定容至10mL,并測定其在270nm處吸收值A(chǔ)。以重蒸水代替PG液重復(fù)上述操作作為空白。將反應(yīng)溫度為40℃條件下,1mL酶液每分鐘使PG液在270nm處減少0.001個吸收值定義為1個酶活力單位。2.3.7單寧酶高活性菌株的產(chǎn)酶穩(wěn)定性參考植酸酶的誘變選育工作，進行了產(chǎn)酶穩(wěn)定性實驗。把上面篩選得到的單寧酶高活性菌連續(xù)傳代轉(zhuǎn)種8次，分別接種入復(fù)篩培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，檢測單寧酶活性，根據(jù)活性變化情況來考察單寧酶高活性菌株的產(chǎn)酶穩(wěn)定性。PAGE622.4實驗結(jié)果與討論2.4.1實驗菌種的初步鑒定由貴州大學(xué)食品實驗室提供2株菌和貴州大學(xué)真菌資源研究所提供3株菌，是根據(jù)方心芳介紹的方法，轉(zhuǎn)接到單寧酸選育培養(yǎng)基上。方先生認為能在單寧酸培養(yǎng)基上生長的菌很少，因為單寧酸具有很強的殺菌作用，但所有黑曲霉都能在其中生長，所以單寧酸培養(yǎng)基是儲藏黑曲霉的一種絕好培養(yǎng)基。一部分青霉雖然也能在其上生長，但其生長的合適溫度不同于黑曲霉。即300C2.4.2出發(fā)菌株的篩選此種平板顯色法利用溴酚蘭的變色范圍與黑曲霉生長過程中ph值變化基本一致的特點，根據(jù)菌落周圍變色圈的大小和顏色深淺，可初步估計黑曲霉菌株的產(chǎn)酶能力。在培養(yǎng)基中加入低劑量的溴酚蘭不會對黑曲霉的生長及單寧酶活性造成不利影響，該方法直觀，操作簡單，準(zhǔn)確。經(jīng)初篩后的菌株產(chǎn)單寧酶的能力和復(fù)篩相比較，結(jié)果一致。經(jīng)反復(fù)比較發(fā)現(xiàn)五株菌中有三株菌活性較高，最后確定用這三株菌（NO.1、NO.2、NO.4）作為出發(fā)菌株進行紫外誘變，選育高產(chǎn)單寧酶的菌株。表2.35株黑曲霉試驗菌種的單寧酶活性菌株編號單寧酶活性菌株編號單寧酶活性1＋＋＋2＋＋＋3＋＋4＋＋＋5＋＋＋＋：單寧酶活性較高；＋＋：單寧酶活性中等；＋：單寧酶活性較低由表中可以看出，黑曲霉NO.1、NO.2、NO.4的單寧酶活性較高，選擇它們作為紫外誘變的出發(fā)菌株誘變育種的原則，即誘變時選用多株出發(fā)菌株。一般要采用3～4株出發(fā)菌，經(jīng)逐代處理比較后，留下產(chǎn)量高，性能好的菌株，這樣容易在短時期內(nèi)達到育種的目的。PAGE622.4.3紫外誘變篩選單寧酶高活性菌株紫外誘變致死曲線將NO1、2、4號菌株的孢子制成懸液，分別取5mL加入三只無菌平皿中進行紫外誘變，誘變剛開始時取樣，以后每間隔0.5min取一次樣，把樣品進行梯度稀釋后涂平板，培養(yǎng)72h后統(tǒng)計菌落數(shù)目，計算誘變致死率。誘變開始時形成的菌落數(shù)－誘變一定時間形成的菌落數(shù)誘變開始時形成的菌落數(shù)－誘變一定時間形成的菌落數(shù)誘變開始時形成的菌落數(shù)誘變致死率（％）＝×100%誘變開始時形成的菌落數(shù)以致死率（％）為縱坐標(biāo)，時間（min）為橫坐標(biāo)可作出這三株菌進行紫外誘變的致死曲線，見圖2.2：圖2.2實驗三株菌紫外誘變的致死曲線從圖2.2可得出，雖然三株菌均為黑曲霉菌株，但對它們作紫外誘變時，它們的誘變致死率在相同時間時是不一樣的。紫外誘變后的初篩由于用小劑量（致死率50～80％）進行誘變處理時，在單位存活細胞中正突變株多，因此現(xiàn)在多選用小劑量。本實驗采用80％左右的致死率，此時對應(yīng)這三株菌的誘變時間分別是3min，4min，4min，它們的誘變及初篩情況如下：NO.1經(jīng)初篩獲得單寧酶活性較高的菌株5株NO.2經(jīng)初篩獲得單寧酶活性較高的菌株7株NO.4經(jīng)初篩獲得單寧酶活性較高的菌株4株借助平板培養(yǎng)顯色法初篩，共得到單寧酶活性較高的黑曲霉菌株16株，PAGE62紫外誘變后高產(chǎn)菌株的復(fù)篩在進一步的搖瓶復(fù)篩過程中，一些菌株的單寧酶活力并未提高甚至降低，另一些菌株則出現(xiàn)較大的回復(fù)突變，高產(chǎn)酶活只能維持1～2代。從16株初篩菌株中進行復(fù)篩，反復(fù)篩選后得6株產(chǎn)酶較高的菌株，這6株菌與出發(fā)菌株的比較情況見下表：表2.4誘變后的菌株與原始出發(fā)菌株比較原始菌株NO.1NO.2NO.4誘變菌株NO.1~1NO.1~2NO.2~1NO.2~2NO.2~3NO.4~1酶活（U/mL）28酶活性較出／發(fā)菌株提高(%)796518213237／9274621481006732／71121由表2.4中可以看出，這6株菌中以NO.2～1單寧酶活性最高。選取NO.2～1作為后續(xù)試驗的出發(fā)菌株。黑曲霉單寧酶高活性菌株的選育為下一步進行的固體發(fā)酵產(chǎn)酶研究打下了堅實的基礎(chǔ)，育種譜系如下圖所示：圖2.3黑曲霉菌株育種篩選系譜圖2.4.4單寧酶高活性菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性進行了產(chǎn)酶穩(wěn)定性試驗，把NO.2～1連續(xù)傳代轉(zhuǎn)種8次，每一代均進行搖瓶培養(yǎng)測定其單寧酶活力，NO.2～1菌株初始酶活力為92U/mL，傳代數(shù)此后，其酶活力略微下降，至第6和第8代菌株時，其酶活力穩(wěn)定在86U/mL，較初始酶活力下降6U／mL。NO.2～1菌株在連續(xù)傳代過程中，酶活力穩(wěn)定在86～92U／mL，見圖2.4。顯示出較高的傳代穩(wěn)定性。該菌株培養(yǎng)到72h時，菌落直徑約2cm，圓形略微凸起，邊緣較為粗糙，基內(nèi)菌絲棕黃色，氣生菌絲淡黃色，孢子顏色棕褐色，菌落周圍是顯著的黃色變色圈。PAGE62圖2.4黑曲霉NO.2～1菌株在不同傳代中單寧酶活性比較2.5本章小結(jié)（1）本研究采用的初篩方法行之有效，結(jié)果簡單明了、快速靈敏，且微量的的溴酚藍（0.004%）加入不會影響到黑曲霉的生長和單寧酶的活性。（2）本研究采用紫外誘變的常規(guī)選育手段進行黑曲霉菌株的誘變，成功的選育到了一株產(chǎn)單寧酶92U/mL的黑曲霉高產(chǎn)菌株。它的單寧酶活性較原始出發(fā)菌株提高了1倍多。而且紫外誘變設(shè)備簡單、方法易行、操作安全、誘變效果好，所選育的菌株遺傳性狀穩(wěn)定。PAGE62第三章單寧酶活力測定方法的構(gòu)建3.1前言由于單寧酶應(yīng)用廣泛，因此建立一種方便快捷的酶活檢測方法非常重要。盡管單寧酶的研究至今已近半個世紀，其酶活力的測定方法卻始終沒有統(tǒng)一，造成不同來源的酶活力值之間難以相互比較。在眾多的單寧酶研究文獻中，研究人員為了滿足各自研究的需要，選用不同的底物、不同的測定參數(shù)，以底物的減少或產(chǎn)物的增加甚至是ph值改變等作為測定對象，構(gòu)建出各具特色的單寧酶酶活力測定方法。這些測定方法大致歸類為滴定法、紫外分光光度法、比色法和高效液相色譜法等。有研究表明［56］固體發(fā)酵與液體發(fā)酵不同，液體發(fā)酵黑曲霉所產(chǎn)酶為胞內(nèi)酶，而固體發(fā)酵黑曲霉所產(chǎn)的單寧酶幾乎全部都是胞外酶，固體發(fā)酵產(chǎn)酶量大，酶活性高。但是由于胞外單寧酶檢測，無法象胞內(nèi)單寧酶那樣幾乎完全除去單寧酸等干擾物質(zhì)，因為胞外單寧酶提取液中往往含有比底物濃度高、具有與底物相似吸收波長的物質(zhì)，這些物質(zhì)干擾底物的吸收光譜，影響吸光值，從而影響檢測的準(zhǔn)確性。上述常用的測定方法只適用于測定胞內(nèi)單寧酶活力，而不適用于測定胞外單寧酶活力。因此找到一種適合檢測胞外單寧酶的方法，解決固體發(fā)酵所產(chǎn)酶，酶活檢測難的問題顯得尤為重要。本論文改進了Shwetasharma［57］建立的酶活測定方法，采用沒食子酸丙酯（PG）作為單寧酶酶促反應(yīng)底物，通過單寧酶水解底物產(chǎn)生的沒食子酸與繞丹寧之間生成的色團物質(zhì)在堿性條件下顯色的原理，對固體發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)胞外單寧酶的活性檢測進行了考察，建立起了一種適合固體發(fā)酵黑曲霉所產(chǎn)胞外單寧酶的酶活檢測方法，本方法簡單、靈敏、重復(fù)性好。3.2實驗材料與方法3.2.1菌種黑曲霉（Aspergillusniger）NO.2～1菌株，由黑曲霉菌株經(jīng)紫外誘變選育而成。菌種在40C條件下保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，PAGE623.2.2培養(yǎng)基菌種保藏培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）固體發(fā)酵培養(yǎng)基單寧酸2.0％，NH4Cl1%w/v,MgSO4.7H2O0.1%w/v，NaCl0.1%w/v，97%麩皮，自然ph值。3.2.4試劑檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖溶液貯備液A：0.1mol/L檸檬酸（C6H8O719.21g配成1000mL貯備液B：0.1mol/L檸檬酸三鈉（C6H5NaO7·2H2O29.41g配成1000mL）根據(jù)溶液ph的要求，貯備液A與貯備液B按照比例混合稀釋。沒食子酸丙酯底物溶液配置濃度為0.01mol/L的沒食子酸丙脂溶液做檢測酶活時的底物，稱取0.021gPG用檸檬酸緩沖溶液定容到10mL。繞丹寧溶液配置濃度為0.667%(W/V)的繞丹寧溶液，稱取0.0667g繞丹寧用甲醇溶液定容到10mL。3.2.5儀器UV2550型紫外－可見分光光度計。PHS-25型精密數(shù)顯酸度計上海偉業(yè)儀器廠生產(chǎn)；TG328A型分析天平奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；梅特勒–托利多AG135天平上海梅特勒儀器公司；電熱恒溫水浴鍋天津太斯特儀器有限公司；YXQ-LS-50SI型立式壓力蒸汽滅菌器上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。3.2.5實驗方法3.2.5用單寧酸和麩皮作為培養(yǎng)基基礎(chǔ)。由NH4Cl1%w/v,MgSO4.7H2O0.1%w/v，NaCl0.1%w/v組成培養(yǎng)基的鹽溶液。取5g單寧酸及麩皮的混合物裝入250mL三角瓶中，加入5mL上述無機鹽溶液，于1210C下滅菌20min，培養(yǎng)基冷卻到室溫后取1mL孢子懸液（11×109個孢子）移入三角錐瓶中，充分振蕩使孢子與培養(yǎng)基混合均勻，放置于300C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h。PAGE623.2.5取出培養(yǎng)箱中含單寧酶的固體培養(yǎng)基質(zhì)，加入50mLph5.0的檸檬酸緩沖液，放置于160r/min搖床上1h后取出，用濾紙過濾即得粗酶液。3.2.5用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品配制沒食子酸溶液。配制濃度為10μmol／L的沒食子酸溶液，取該溶液0.5mL加入0.3mL甲醇繞丹寧（0.05mol/L）溶液，放入30℃水浴中保溫5min，再在試管中加入0.2mL（0.5mol/L）的KOH溶液，再保溫5min，加入4mL3.2.5用ph5.0的檸檬酸緩沖溶液來配制不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，從40μmol/L－260μmol/L配制12個不同的濃度梯度。分別取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL，0.3mL甲醇繞丹寧溶液(0.05mol/L)加到所有試管中，在30℃條件下反應(yīng)5min。0.2mL氫氧化鉀(0.5mol/L)溶液加入到所有的試管后再次在30℃條件下恒溫5min，最后在所有試管中加入蒸餾水4mL稀釋，以蒸餾水作空白，用紫外－可見分光光度計在520nm波長下檢測沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值，得到?jīng)]食子酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.2.5此方法是根據(jù)沒食子酸（單寧酶催化沒食子酸丙酯水解產(chǎn)生）與甲醇繞丹寧之間形成色團物質(zhì)的方法來測定單寧酶的活性，將30℃條件下每分鐘產(chǎn)生1μmol沒食子酸所需的酶量定義為一個酶活單位。取三支潔凈的試管分別標(biāo)記為空白管、測試管、對照管。將底物沒食子酸丙酯以及粗酶液在反應(yīng)開始之前先放入30℃水浴中預(yù)熱5～10min。在被標(biāo)記的三支試管中都加入0.25mL沒食子酸丙酯溶液，接著0.25mL檸檬酸緩沖液加入空白管中，0.25mL粗酶液加入到測試管中后將三支試管都放入30℃水浴中保溫5min，然后在所有試管中都加入0.3mL甲醇繞丹寧(0.05mol/L)溶液，30℃水浴中保持5min，在這之后取濃度為0.5mol／L的氫氧化鉀0.2mL加入所有試管中，在30℃水浴中保持5min，然后僅在對照管的反應(yīng)混合物中加入0.25mL粗酶液。最后每支試管都用4mL蒸餾水稀釋，在30℃下保溫5～10min后在520nm波長下用蒸餾水做空白，測定反應(yīng)混合物的吸光值。所有測試都做三個重復(fù)。單寧酶的活性由吸光值的變化來計算ΔA520＝(Atest－Ablank)－(Acontrol－Ablank).PAGE623.2.5反應(yīng)溫度30℃條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol沒食子酸所需的酶量定義為一個酶活單位（U）。采用SadaakiIibuchi等[22]于1967年建立的紫外分光光度法：將0.3g單寧酸溶于1OOmLO.OlM乙酸緩沖液(ph5.0)中，配制成底物溶液。取4mL底物溶液于試管，加入lmL酶液迅速混合，置37℃水浴鍋反應(yīng)5min后，取O.lmL反應(yīng)液，加入5m190%乙醇終止反應(yīng)，混勻，測定光吸收值A(chǔ)310(單寧酸在310nm處有最大光吸收)；采用王征[55]等改進的酶活測定方法：取4支潔凈的10mL具塞試管,分別設(shè)定為對照平行管與測定平行管。在每支試管中先后各加入1mol/L檸檬酸緩沖液和1mL酶液,40℃下平衡5min,先將4mL99%乙醇加入對照管中,使酶失活。5min后,在4支試管中加入底物PG溶液,40℃保溫,準(zhǔn)確反應(yīng)10min,同法終止測定管的酶促反應(yīng)。從上述4支反應(yīng)管中各取1mL反應(yīng)液,分別定容至10mL,并測定其在270nm處吸收值A(chǔ)。以重蒸水代替PG液重復(fù)上述操作作為空白。將反應(yīng)溫度為40℃條件下,1mL酶液每分鐘使PG液在270nm處減少0.001個吸收值定義為1個酶活力單位；再3.3實驗結(jié)果與討論3.3.1沒食子酸吸收峰波長圖3.1沒食子酸可見光區(qū)吸收光譜圖由圖可見沒食子酸在可見光區(qū)的特征吸收峰在520nm處，與Shwetasharma[57]PAGE62的報道相符，該波長不僅避開了培養(yǎng)基中單寧酸的特征吸收波長310nm，而且還避開核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收波長260nm、280nm，從而在單寧酶活力測定過程中盡可能的減少上述物質(zhì)對測定的干擾。由于固體發(fā)酵產(chǎn)胞外酶，提取的單寧酶粗酶液中含有大量的雜質(zhì)，這些雜質(zhì)都會影響測定水解產(chǎn)生的沒食子酸的量。而采用520nm這個波長，成功的避開了其他物質(zhì)的干擾，設(shè)定空白管、對照管更增加了酶活檢測的準(zhǔn)確性。3.3.2沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程圖3.2顯示，波長520nm處沒食子酸濃度與其對應(yīng)的吸光值線性相關(guān)。對該組數(shù)據(jù)進行直線回歸分析，得到直線回歸方程：Y＝0.0042X-0.0138（r2=0.9992）.相關(guān)系數(shù)r≈1，表明水解生成物GA濃度（X）與其對應(yīng)的吸光值（Y）線性相關(guān)顯著。表3.1波長520nm下不同沒食子酸濃度的對應(yīng)吸光值濃度（μmol/L）concentration406080100120140160180200220240260吸光值absorbency0.1610.2410.3200.4020.4840.5630.6410.7500.8350.9010.9801.167AbsorbencAbsorbencyConcentrationofGA(μmol/L)圖3.2波長520nm處沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖PAGE623.3.3單寧酶活力測定圖3.3空白管(左)、測試管(中)、對照管(右)加入繞丹寧后的顯色情況由圖3.3可看出本論文建立的方法直觀有效，可觀察到明顯的顏色變化。另外本方法非常靈敏，單寧酶水解底物產(chǎn)生微量的沒食子酸都能檢測到，濃度最小可達到5nmol。而Inoue和Hagerman［58］確定的方法，沒食子酸的靈敏度為10μg(53nmol)。終止酶活時一般方法都是采用沸水浴、加入有機溶劑或者用液氮突然冷凍的方法，本實驗在反應(yīng)混合物中加入甲醇繞丹寧溶液有兩方面的作用，一是可以終止酶活，二是可以與沒食子酸結(jié)合形成色團物質(zhì)，不需使用沸水或有機溶劑滅活，減少了對吸光值的干擾因素。吸光值在反應(yīng)5min時達到最大，在此后20min內(nèi)幾乎沒有變化。3.3.4單寧酶活力測定方法比較表3.2不同單寧酶活力測定方法比較紫外光區(qū)270nm波長下檢測酶活紫外光區(qū)310nm波長下檢測酶活可見光區(qū)520nm波長下檢測酶活A(yù)testAcontrolAt-cAtestAcontrolAt-cAtestAcontrolAt-c2.9552.8510.1043.3183.1320.1860.9610.1770.7842.9272.7400.1873.4833.3120.1710.9540.2080.7462.9202.7840.1363.3853.2800.1050.9320.1950.737現(xiàn)在國內(nèi)的研究者在進行單寧酶活性測定時常用的方法主要有SadaakiIibuchi等[22]于PAGE621967年建立的紫外分光光度法,基本原理是根據(jù)底物單寧在310nm處吸光度的變化求酶活力；王征[23]的酶活檢測方法，其方法在SadaakiIibuchi［22］構(gòu)建的方法上作了改進，采用了沒食子酸丙酯（PG）作為單寧酶底物，取得了較好的效果。表3.2數(shù)據(jù)表明，270nm下檢測到的吸收值、310nm下檢測到的吸收值均表現(xiàn)出大于1，處于2～3之間甚至>3,由此而得到的酶活力At-c值的可信度很小。隨后將被測液的稀釋倍數(shù)增加到100倍時，Ac和At的值才降至0～1之間，但由于稀釋倍數(shù)過大造成的誤差值增大，因此At-c值的可信度也不高。而在520nm下檢測到的吸收值，將稀釋倍數(shù)控制在5～10倍之間，Ac、At值均小于1，吸光值在測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。Ac、At和At-c值的誤差均不超過2％，這表明在520nm下測定固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶酶活的方法具有很高的精確度。分析原因，是由于固體發(fā)酵所產(chǎn)的幾乎全為胞外酶，胞外酶的提取無法像胞內(nèi)單寧酶提取那樣幾乎完全除去單寧酸等干擾物質(zhì)，胞外單寧酶提取液中往往含有比底物濃度高，具有與底物相似吸收波長的物質(zhì)，如培養(yǎng)基中的單寧酸和水解產(chǎn)物沒食子酸及雜蛋白等干擾物質(zhì)，干擾底物吸收光譜（額外增加對特征光譜的吸收）。盡管SadaakiIibuchi[22]等研究中單寧酸的特征吸收波長是310nm，但其所用的單寧酸是經(jīng)過多次提取的純品。而事實上多數(shù)研究中的單寧酸均為粗品，其特征吸收波長介于270～290nm之間，就會不可避免的干擾底物的吸光值。胞外酶粗酶液中的很多雜質(zhì)的