外源基因表達(dá)系統(tǒng)受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件限制性缺陷型外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷〔recB-，recC-，hsdR-〕防止修飾和降解重組整合缺陷型防止重組整合用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞〔recA-〕感染寄生缺陷型防止感染防止重組細(xì)菌擴(kuò)散污染，生物武器除外具有較高的轉(zhuǎn)化效率較高的可轉(zhuǎn)化性具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型利于篩選各種基因工程受體的特性大腸桿菌遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，重組子穩(wěn)定產(chǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素適用于外源DNA的擴(kuò)增和克隆、原核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫(kù)的構(gòu)建DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要受體菌人胰島素、生長(zhǎng)激素、干擾素等各種基因工程受體的特性枯草〔芽孢〕桿菌遺傳背景清楚，胞外酶分泌-調(diào)節(jié)基因，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制健全，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，不產(chǎn)內(nèi)毒素。適用于原核生物基因的克隆、表達(dá)以及重組蛋白多肽的有效分泌。遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備人β干擾素、白介素等各種基因工程受體的特性鏈霉菌抗生素的主要生產(chǎn)者，分子遺傳相對(duì)操作簡(jiǎn)便，不產(chǎn)內(nèi)毒素，主要用于抗生素生產(chǎn)菌株的改進(jìn)。遺傳不穩(wěn)定，生長(zhǎng)相對(duì)緩慢各種基因工程受體的特性酵母具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單；外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定；具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)；內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高；適用于外源DNA的擴(kuò)增、克隆以及真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫(kù)的構(gòu)建、真核生物基因表達(dá)調(diào)控的研究；DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程重要的真核受體細(xì)胞。各種基因工程受體的特性昆蟲(chóng)細(xì)胞〔家蠶〕具有真核生物的特征，外源基因表達(dá)量高，繁殖相對(duì)較快，培養(yǎng)本錢低廉，遺傳穩(wěn)定；適用于真核生物基因的高效表達(dá)；DNA重組操作系統(tǒng)欠完善。各種基因工程受體的特性哺乳動(dòng)物細(xì)胞〔CHO、Hela〕與人的親緣關(guān)系近，分子重組表達(dá)系統(tǒng)健全，具有適宜的糖基化修飾系統(tǒng)；適用于哺乳類動(dòng)物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)；DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要哺乳動(dòng)物受體；細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，生長(zhǎng)緩慢。各種基因工程受體的特性植物細(xì)胞〔擬南芥菜、煙葉〕農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)意義重大，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞易于分化，細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)單且本錢低廉，具有光合作用，適用于高等植物基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因藥物的生產(chǎn)，農(nóng)作物品質(zhì)的改進(jìn)。遺傳操作繁瑣。外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)A大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征B外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理C大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略D基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策E利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌特征大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開(kāi)放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為平安的基因工程受體生物大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌特征大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能無(wú)特異性空間構(gòu)象的多肽鏈缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)糖基化和磷酸化等內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素人體熱原反響外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理啟動(dòng)子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子質(zhì)粒拷貝數(shù)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)TAGATG核糖體識(shí)別區(qū)ORF終止區(qū)啟動(dòng)子啟動(dòng)子是一段提供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。?強(qiáng)啟動(dòng)子起始合成mRNA的效率高，弱啟動(dòng)子合成的效率低。大腸桿菌啟動(dòng)子的強(qiáng)弱取決于啟動(dòng)子本身的序列，尤其是-10區(qū)〔TATAAT〕和-35區(qū)(TTGACA)兩個(gè)六聚體的堿基組成以及彼此的間隔長(zhǎng)度，同時(shí)也與啟動(dòng)子和外源基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間的距離有很大關(guān)系。大腸桿菌大多數(shù)啟動(dòng)子與所屬基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間的距離為6-9個(gè)堿基啟動(dòng)子的可控性外源基因的全程高效表達(dá)往往會(huì)對(duì)大腸桿菌的生理生化過(guò)程造成不利影響；通過(guò)可控性的啟動(dòng)子調(diào)整外源基因表達(dá)的時(shí)序，即通過(guò)啟動(dòng)子活性的定時(shí)誘導(dǎo)，將外源基因的轉(zhuǎn)錄控制在受體細(xì)胞生長(zhǎng)的某一特定階段。啟動(dòng)子的可控性乳糖啟動(dòng)子Plac的可控性野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基基底水平轉(zhuǎn)錄底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高啟動(dòng)子的可控性色氨酸啟動(dòng)子Ptrp的可控性色氨酸啟動(dòng)子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者參加3-吲哚丙烯酸〔IAA〕，便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)的目基因的表達(dá)。終止子強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過(guò)頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過(guò)終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，形成長(zhǎng)短不一的mRNA混合物過(guò)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá)，其原因如下：1.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時(shí)間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降：2.如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，那么RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；3.過(guò)長(zhǎng)的mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無(wú)用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無(wú)謂的能量消耗；4.更為嚴(yán)重的是，過(guò)長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。終止子強(qiáng)終止子的選擇與使用目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來(lái)自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tφ。對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通常可以采用二聚體終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用。終止子也可以象啟動(dòng)子那樣，通過(guò)特殊的探針質(zhì)粒從細(xì)菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選。核糖體結(jié)合位點(diǎn)外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。mRNA翻譯的起始效率主要由其5'端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)〔RBS〕。核糖體結(jié)合位點(diǎn)大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)特征結(jié)構(gòu)四個(gè)要素位于翻譯起始密碼子上游的6-8個(gè)核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno〔SD〕序列，它通過(guò)識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大局部基因以AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn)，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成；基因編碼區(qū)5’端假設(shè)干密碼子的堿基序列.核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響SD序列的影響：一般來(lái)說(shuō)，mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD序列與16SrRNA的堿基互補(bǔ)性，其中以GGAG四個(gè)堿基序列尤為重要。對(duì)多數(shù)基因而言，上述四個(gè)堿基中任何一個(gè)換成C或T，均會(huì)導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低。核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響SD序列與起始密碼子之間的序列的影響SD序列下游的堿基假設(shè)為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率那么分別是最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個(gè)堿基成份對(duì)翻譯起始也有影響，對(duì)于大腸桿菌β-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個(gè)位置上最正確的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，那么酶的表達(dá)水平低20倍。核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響SD序列與起始密碼子之間的距離的影響SD序列與起始密碼子之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處，在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低。核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響起始密碼子及其后續(xù)假設(shè)干密碼子的影響大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時(shí)識(shí)別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識(shí)別頻率并不相同，通常GUG為AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。從AUG開(kāi)始的前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否那么便會(huì)嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。目前廣泛用于外源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，均含有與啟動(dòng)子來(lái)源相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，序列和間隔是最正確的。密碼子生物體對(duì)密碼子的偏愛(ài)性不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛(ài)性，其決定因素是：生物基因組中的堿基含量在富含AT的生物基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高；而在GC豐富的生物基因組中，第三位上含有G或C的簡(jiǎn)并密碼子占90%以上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)密碼子與反密碼子相互作用的自由能中等強(qiáng)度規(guī)律如GGG、CCC、AUA、UAU等使用少；如GUG、CAC、UCG、AGC等使用多；細(xì)胞內(nèi)tRNA的含量表達(dá)量大的基因含有較少種類的密碼子和對(duì)應(yīng)的含量較高的tRNA分子。密碼子密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因表達(dá)的影響由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程度的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最正確表達(dá)：外源基因全合成同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因密碼子密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因表達(dá)的影響外源基因全合成按照大腸桿菌密碼子的偏愛(ài)性規(guī)律，設(shè)計(jì)更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡(jiǎn)并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長(zhǎng)激素在大腸桿菌中的高效表達(dá)均采用了這種方法。密碼子密碼子偏愛(ài)性對(duì)外源基因表達(dá)的影響同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因?qū)τ谀切┖胁缓椭C密碼子種類單一、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言，那么選擇相關(guān)tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)的策略較為有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412個(gè)密碼子中，共含有22個(gè)精氨酸密碼子，其中7個(gè)AGG、2個(gè)AGA，而大腸桿菌受體細(xì)胞中tRNAAGG和tRNAAGA的豐度較低。為了提高人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將大腸桿菌的這兩個(gè)tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高表達(dá)的質(zhì)粒上。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細(xì)胞對(duì)外源基因高效表達(dá)的制約作用。質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒拷貝數(shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過(guò)程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過(guò)度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降。解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道。質(zhì)粒拷貝數(shù)質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子，在28℃時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)為60，在42℃時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至300–600。在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的CI基因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活，pL開(kāi)放并啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。因此，用一種手段同時(shí)控制質(zhì)?？截悢?shù)和基因的表達(dá)。大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略外源蛋白在大腸桿菌中不穩(wěn)定的原因大腸桿菌缺乏針對(duì)重組異源蛋白的折疊復(fù)性和翻譯后加工系統(tǒng)；大腸桿菌不具備真核細(xì)胞完善的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及眾多的穩(wěn)定分子；高效表達(dá)的重組異源蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中形成高濃度微環(huán)境，致使蛋白分子間的相互作用增加。外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)包涵體型異源蛋白的表達(dá)分泌型異源蛋白的表達(dá)融合型異源蛋白的表達(dá)寡聚型異源蛋白的表達(dá)整合型異源蛋白的表達(dá)包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體及其性質(zhì)在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體〔InclusionBodies，IB〕。富含蛋白質(zhì)的包涵體多見(jiàn)于生長(zhǎng)在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細(xì)胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會(huì)喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。此外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)能簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的別離操作包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過(guò)高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中別離出來(lái).能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用根本上對(duì)異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅.包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過(guò)有效的變性/復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象〔因而具有生物活性〕的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。然而，這也是一個(gè)技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過(guò)30%。包涵體型異源蛋白的表達(dá)以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的操作如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)〔如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)〕，外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量20%以上時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。因此，以包涵體形式表達(dá)目的基因操作的關(guān)鍵就是選擇高表達(dá)的載體。事實(shí)上，這種高表達(dá)率也是包涵體法的長(zhǎng)處所在。包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的溶解與變性包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開(kāi)錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵，在人工條件下，使包涵體溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。包涵體的溶解與變性能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件清洗劑SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化促溶劑鹽酸胍(貴)、尿素(廉價(jià))，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，氰酸鹽能與多肽鏈中的氨基反響混合溶劑如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng)極端pH廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反響包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作包涵體的復(fù)性與重折疊〔refolding〕通過(guò)次級(jí)鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性將多肽鏈中被拆開(kāi)的游離巰基重新折疊分泌型異源蛋白的表達(dá)在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白按其在細(xì)胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性〔包涵體〕狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；或者通過(guò)運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過(guò)外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號(hào)肽序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件。分泌型異源蛋白的表達(dá)分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)目的蛋白穩(wěn)定性高重組人胰島素原假設(shè)分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn)穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍目的蛋白易于別離目的蛋白末端完整相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如假設(shè)將外源基因與大腸桿菌的信號(hào)肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過(guò)程中被有效除去。分泌型異源蛋白的表達(dá)分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。分泌型異源蛋白的表達(dá)分泌型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建包括大腸桿菌在內(nèi)的絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分泌到胞外，但有些革蘭氏陰性菌能將細(xì)菌的抗菌蛋白〔細(xì)菌素〕分泌到培養(yǎng)基中，這一過(guò)程嚴(yán)格依賴于細(xì)菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi)上的磷酸酯酶，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外膜的通透性增大。因此，只要將細(xì)菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個(gè)適宜的質(zhì)粒上即可構(gòu)建完全分泌型的受體細(xì)胞。此時(shí)，用另一種攜帶大腸桿菌信號(hào)肽編碼序列和目的基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述完全分泌型受體細(xì)胞，并使用相同性質(zhì)的啟動(dòng)子介導(dǎo)目的基因的轉(zhuǎn)錄，那么可實(shí)現(xiàn)目的蛋白從重組大腸桿菌中的完全分泌。融合型異源蛋白的表達(dá)除了直接表達(dá)異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個(gè)開(kāi)放型閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細(xì)菌的蛋白局部位于N端，異源蛋白位于C端。通過(guò)在DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白。融合型異源蛋白的表達(dá)以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白穩(wěn)定性高尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳目的蛋白易于別離利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白目的蛋白表達(dá)率高與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件目的蛋白溶解性好由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性目的蛋白需要回收融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步別離，才能獲目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的本錢往往就在該工段融合型異源蛋白的表達(dá)融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原那么受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達(dá)，且其表達(dá)產(chǎn)物可以通過(guò)親和層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)十分重要，它直接決定著融合蛋白的裂解工藝為目的蛋白別離回收創(chuàng)造條件外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，目的是盡可能防止融合蛋白分子中兩種組份的分子量過(guò)于接近兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架融合型異源蛋白的表達(dá)用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶〔GST〕維持良好空間構(gòu)象硫氧化復(fù)原蛋白〔TrxA〕維持良好空間構(gòu)象pTrxFus麥芽糖結(jié)合蛋白〔MBP〕促進(jìn)分泌金黃色葡萄球菌蛋白A〔SAPA〕免疫親和層析pRIT2T外膜蛋白〔OmpF〕促進(jìn)分泌β-半乳糖苷酶〔LacZ〕免疫親和層析泛素蛋白〔Ubi〕維持良好空間構(gòu)象融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收融合蛋白中受體蛋白局部的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反響，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白局部完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法有兩種：化學(xué)斷裂法酶促裂解法融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收--化學(xué)斷裂法用于蛋白位點(diǎn)專一性化學(xué)斷裂的最正確試劑為溴化氰〔CNBr〕，它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反響，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段，其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高〔可到達(dá)85%以上〕，專一性強(qiáng)，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，那么不能用此方法。融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收--酶促裂解法蛋白酶酶促裂解法的特點(diǎn)是斷裂效率更高，同時(shí)每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點(diǎn)決定簇，因此可供選擇的專一性斷裂位點(diǎn)范圍較廣。幾種斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開(kāi)酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。融合型異源蛋白的表達(dá)目的蛋白的回收--多殘基位點(diǎn)為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來(lái)的應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列〔Ile-Glu-Gly-Arg〕的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子X(jué)a的識(shí)別和作用序列，其斷裂位點(diǎn)在Arg的C末端。純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物。融合型異源蛋白的表達(dá)

寡聚型異源蛋白的表達(dá)從理論上講，外源基因的表達(dá)水平與受體細(xì)胞中可轉(zhuǎn)錄基因的拷貝數(shù)〔即基因劑量〕呈正相關(guān)。然而重組質(zhì)粒除了含有外源基因外，還攜帶其它的可轉(zhuǎn)錄基因，如作為篩選標(biāo)記的抗生素抗性基因等。隨著重組質(zhì)?？截悢?shù)的不斷增加，受體細(xì)胞內(nèi)的大局部能量和原料被用于合成所有的重組質(zhì)粒編碼蛋白，而細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝卻因能量不濟(jì)受到影響，因此通過(guò)增加質(zhì)?？截悢?shù)提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量往往不能獲得滿意的效果。另一種通過(guò)增加外源基因劑量而提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量的有效方法是構(gòu)建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達(dá)載體，即將多拷貝的外源基因克隆在一個(gè)低拷貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達(dá)的策略。寡聚型異源蛋白的表達(dá)以寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白高效表達(dá)在不提高質(zhì)粒拷貝數(shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù)，可以在一定程度上改善表達(dá)量。穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽短肽由于缺乏有效的空間結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌細(xì)胞中的半衰期較短。串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長(zhǎng)度及空間結(jié)構(gòu)，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高。目的產(chǎn)物回收困難寡聚短肽需要裂解和進(jìn)一步別離，才能獲最終分子，但裂解后的短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性。寡聚型異源蛋白的表達(dá)寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建整合型異源蛋白的表達(dá)以整合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的基因穩(wěn)定表達(dá)整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制，在大多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒(méi)有選擇壓力存在下可以連續(xù)培養(yǎng)而不喪失目的基因表達(dá)盒，這對(duì)以改進(jìn)物種遺傳性狀為目的的基因工程案例特別有意義。目的基因表達(dá)率低單拷貝整合的目的基因表達(dá)率受到限制，此時(shí)可通過(guò)強(qiáng)化表達(dá)元件而加以補(bǔ)償。整合型異源蛋白的表達(dá)DNA體內(nèi)重組的根本原理在生物體細(xì)胞尤其是原核細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機(jī)制，其可能的生物學(xué)成效是促進(jìn)生物種群的進(jìn)化。整合型異源蛋白的表達(dá)整合型異源蛋白的表達(dá)胰島素是由胰腺中胰島的β-細(xì)胞分泌的一種含有51個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)激素。胰島素由兩條多肽鏈組成，生理功能主要是促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖；促進(jìn)肝糖原和肌糖原的合成；抑制肝糖原的分解?；蚬こ趟幬镏圃炖缡澜缟系谝焕悄虿?yīng)用胰島素治療獲成功1921年5月，Banting和Best：結(jié)扎狗胰管，從萎縮的胰腺組織中提取物具降糖作用1922年1月，多倫多總醫(yī)院一名14歲患嚴(yán)重糖尿病的女孩(LeonardTh