蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的高分子有機(jī)化合物，因此其性質(zhì)必定有一部分與氨基酸相同或相關(guān)，例如兩性解離及等電點(diǎn)、紫外吸收性質(zhì)、呈色反應(yīng)等等。但是，蛋白質(zhì)作為高分子化合物，它又表現(xiàn)出與低分子化合物有根本區(qū)別的大分子特性，如膠體性、變性和免疫學(xué)特性等。蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)一、

蛋白質(zhì)的分子量二、

蛋白質(zhì)的兩性電離與等電點(diǎn)三、

蛋白質(zhì)的變性四、

蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)五、

蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)六、

蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)七、

蛋白質(zhì)的含量測(cè)定（1）蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)蛋白質(zhì)是一類(lèi)高分子化合物，在溶液中的形狀根據(jù)不對(duì)稱(chēng)常數(shù)分為球形、橢圓形、纖維狀等。分子量一般為104~106道爾頓或更高，通常將分子量低于1萬(wàn)者稱(chēng)為多肽，高于1萬(wàn)者稱(chēng)為蛋白質(zhì)。當(dāng)然這種界限并不是很?chē)?yán)格的，如胰島素的分子量為5437，但習(xí)慣上稱(chēng)作蛋白質(zhì)，有時(shí)亦稱(chēng)多肽。高分子特性是蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)，也是蛋白質(zhì)膠體性、變性和免疫學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)。因此，測(cè)定蛋白質(zhì)分子的大小是蛋白質(zhì)化學(xué)的重要內(nèi)容。測(cè)定蛋白質(zhì)分子量有超速離心法、凝膠過(guò)濾法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、生物質(zhì)譜法等。1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（1）蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)凝膠過(guò)濾法：也稱(chēng)分子排阻/分子篩層析蛋白質(zhì)分子通過(guò)凝膠柱的速度并不直接取決于分子的質(zhì)量，而是斯托克半徑。如果某種蛋白質(zhì)與一理想的非水化球體具有相同的過(guò)柱速度即相同的洗脫體積，則認(rèn)為這種蛋白質(zhì)具有與此球體相同的半徑，稱(chēng)斯托克半徑測(cè)定方法：先測(cè)幾種相對(duì)分子質(zhì)量已知的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物的過(guò)柱體積Ve，做Mr的對(duì)數(shù)與Ve標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，然后測(cè)出待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的Ve，從標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中確定樣品的Mr1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（1）蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)凝膠過(guò)濾法：也稱(chēng)分子排阻/分子篩層析大分子沿著凝膠顆粒之間的空隙移動(dòng)，先洗脫出來(lái)小分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，后洗脫出來(lái)常用的填充材料是葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（1）蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳法：聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)依據(jù)：不同蛋白質(zhì)所帶電荷(電荷效應(yīng))和大小差異(分子篩效應(yīng))SDS：加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，消除電荷的差異1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)測(cè)出的是亞基的Mr，若待測(cè)蛋白質(zhì)是多亞基的，則需配合使用凝膠過(guò)濾法確定整個(gè)分子的Mr（2）蛋白質(zhì)的兩性電離與等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)蛋白質(zhì)由氨基酸組成。AA分子含有氨基和羧基，既可接受質(zhì)子，又可釋放質(zhì)子，因此AA是兩性電解質(zhì)。蛋白質(zhì)分子中除兩末端有自由的α-NH2和α-COOH外，許多AA殘基的側(cè)鏈上有不少可解離基團(tuán)，如-NH2、-COOH、-OH等，故蛋白質(zhì)也是兩性物質(zhì)蛋白質(zhì)與氨基酸一樣在純水溶液和結(jié)晶狀態(tài)中都以?xún)尚噪x子的形式存在，即同一分子中可帶有正負(fù)兩種電荷，羧基帶負(fù)電而氨基帶正電。1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（2）蛋白質(zhì)的兩性電離與等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)蛋白質(zhì)在溶液中的帶電情況主要取決于溶液的pH。使蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷相等，凈電荷為零時(shí)溶液的pH，稱(chēng)為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint，pI)。各種蛋白質(zhì)具有特定的等電點(diǎn)，這與其所含的AA種類(lèi)和數(shù)目有關(guān)，即其中酸性和堿性AA的比例及可解離基團(tuán)的解離度。蛋白質(zhì)的等電聚焦1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（2）蛋白質(zhì)的兩性電離與等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)一般地說(shuō)，含酸性AA較多的酸性蛋白，等電點(diǎn)偏酸；含堿性AA較多的堿性蛋白，等電點(diǎn)偏堿。當(dāng)溶液的pH>pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷；pH<pI時(shí)，則帶正電荷。體內(nèi)多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為5左右，所以在生理?xiàng)l件下(pH≈7.4)，它們多以負(fù)離子形式存在

1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（2）蛋白質(zhì)的兩性電離與等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)等電點(diǎn)處的蛋白質(zhì)的特點(diǎn)：蛋白質(zhì)在pI時(shí)，以?xún)尚噪x子的形式存在，總凈電荷為零，無(wú)電荷排斥，容易結(jié)合成較大的聚集體，所以溶解度最小，容易沉淀析出（應(yīng)用：分離、提純）蛋白質(zhì)的黏度、滲透壓、膨脹性以及導(dǎo)電能力均為最小1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)高分子特性形成了復(fù)雜而特定的空間構(gòu)象，表現(xiàn)出特異的生物學(xué)功能。某些物理和化學(xué)因素使蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變或破壞，導(dǎo)致其生物活性的喪失和一些理化性質(zhì)的改變，這種現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)的變性作用(denaturation)（3）蛋白質(zhì)的變性(denaturation)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)次級(jí)鍵破壞(本質(zhì))，一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，組成成分和Mr不變生物活性丟失（最主要的特征）酶-催化能力、血紅蛋白-氧運(yùn)輸、胰島素-降血糖理化性質(zhì)改變基團(tuán)暴露疏水基團(tuán)→溶解度↓→沉淀析出←肽鏈松散，相互纏繞反應(yīng)基團(tuán)（-SH、-S-S-基、酚羥基等）結(jié)晶能力喪失球狀蛋白質(zhì)分子形狀發(fā)生改變（3）蛋白質(zhì)的變性(denaturation)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)RNase的變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn)去除尿素和巰基乙醇牛胰RNase共有124個(gè)AA殘基，4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵復(fù)性過(guò)程中-S-S-正確連接的概率：

***1=一級(jí)結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（3）蛋白質(zhì)的變性(denaturation)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（3）蛋白質(zhì)的變性(denaturation)引起蛋白質(zhì)變性的因素物理因素：高溫、紫外線、X-射線、超聲波和劇烈振蕩等；化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、去污劑、重金屬(Hg2+、As+、Pb2+)、三氯醋酸、濃乙醇等變性的種類(lèi)可逆變性：除去變性物質(zhì)后，蛋白質(zhì)的構(gòu)象可以恢復(fù)原狀，生物功能也隨之恢復(fù)(蛋白質(zhì)的復(fù)性(renaturation))不可逆變性：除去變性因素時(shí)，蛋白質(zhì)的構(gòu)象不恢復(fù)原狀，生物功能也不恢復(fù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（3）蛋白質(zhì)的變性(denaturation)變性作用不僅對(duì)研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能方面有重要的理論價(jià)值，而且對(duì)醫(yī)藥的生產(chǎn)和應(yīng)用亦有重要的指導(dǎo)作用實(shí)踐中對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用有不同的要求，有時(shí)必須盡力避免，而有時(shí)則必須充分利用：酒精、紫外線消毒，高溫、高壓滅菌→細(xì)菌蛋白變性失去活性中草藥有效成分提取或其注射液制備→加熱、濃乙醇等除去雜蛋白制備有生物活性的酶，蛋白質(zhì)，激素或其他生物制品(疫苗、抗毒素等)時(shí)，要求所需成分不變性，而不需的雜蛋白應(yīng)變性或沉淀除去。此時(shí)，應(yīng)選用適當(dāng)方法，嚴(yán)格控制操作條件，盡量減少所需蛋白質(zhì)變性。有時(shí)還可加些保護(hù)劑、抑制劑等以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的抗變性能力蛋白質(zhì)變性的意義（4）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)是高分子化合物。由于其分子量大，在溶液中所形成的顆粒大小為1-100nm，達(dá)到膠體質(zhì)點(diǎn)的范圍，所以蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)。如布朗運(yùn)動(dòng)、光散射現(xiàn)象、不能透過(guò)半透膜以及具有吸附能力等膠體溶液的一般特征蛋白質(zhì)的水溶液是比較穩(wěn)定的親水膠體：表面帶有跟水具有高度親和性的極性基團(tuán)(-NH2、-COOH、-OH、-SH、-CONH2)，在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水膜(又稱(chēng)水化層)→不易聚集→不易沉淀同一種蛋白質(zhì)分子在非pI時(shí)帶有同種電荷→相互排斥→不致互相凝集沉淀電荷+水膜→膠體中和電荷/破壞水膜→沉淀溫和→非變性的蛋白質(zhì)沉淀強(qiáng)烈→蛋白質(zhì)變性沉淀（5）蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（5）蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)沉淀的方法：高濃度鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等中性鹽使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀(鹽析法)(破壞水膜，中和電荷)蛋白質(zhì)不變性→分離制備有活性的蛋白質(zhì)分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出，如：血清→硫酸銨至50%飽和度(析出球蛋白)→硫酸銨至飽和(析出清蛋白)；鹽溶：在蛋白質(zhì)水溶液中，加入少量的中性鹽會(huì)增加蛋白質(zhì)分子表面的電荷，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子與水分子的作用，從而使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度增大有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮等破壞蛋白質(zhì)分子周?chē)乃さ蜏貤l件下，蛋白質(zhì)一般不變性，沉淀效果優(yōu)于鹽析pI條件下效果更好（5）蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)重金屬鹽：蛋白質(zhì)在堿性溶液中帶負(fù)離子，可與重金屬(氯化高汞、硝酸鹽、醋酸鉛、三氯化鐵)的正離子作用生成不易溶解的鹽蛋白質(zhì)變性，沉淀效率高，常用除去樣品蛋白質(zhì)雜質(zhì)化驗(yàn)血清非蛋白成分，用三氯醋酸或鎢酸鹽沉淀蛋白質(zhì)加某些酸類(lèi)：苦味酸、單寧酸、三氯乙酸等能和蛋白質(zhì)形成不溶解的鹽蛋白質(zhì)變性，常用除去樣品蛋白質(zhì)雜質(zhì)（5）蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)加熱：使大多數(shù)蛋白質(zhì)變性沉淀，去除樣品中蛋白質(zhì)雜質(zhì)的常用方法調(diào)節(jié)溶液pH（6）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)雙縮脲反應(yīng)：由兩分子尿素縮合而成的雙縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物肽鍵的反應(yīng)定性或定量(540nm處比色)酚試劑(福林試劑)反應(yīng)：酪氨酸中的酚基能將福林試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量，靈敏度>雙縮脲法（7）蛋白質(zhì)含量的測(cè)定蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)凱氏定氮法：N在蛋白中的平均含量16%，測(cè)可溶性和不溶性蛋白的總蛋白含量蛋白質(zhì)含量=(總氮含量-無(wú)機(jī)氮含量)×6.25不能區(qū)分蛋白氮和非蛋白氮，計(jì)算出的蛋白含量稱(chēng)作粗蛋白含量系數(shù)6.25對(duì)某些蛋白質(zhì)不合適，需要用校正后的系數(shù)紫外吸收法：蛋白質(zhì)（Tyr、Trp和Phe）在280nm左右有強(qiáng)烈的光吸收，測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的A280nm和A260nm（準(zhǔn)確度不高）蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）=1.45A280nm-0.47A260nm（7）蛋白質(zhì)含量的測(cè)定蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色法：室溫，反應(yīng)迅速（2min），生成物穩(wěn)定，測(cè)定蛋白質(zhì)含量的靈敏度較高（ug）（7）蛋白質(zhì)含量的測(cè)定蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)福林-酚試劑法(Lowry法)：測(cè)定蛋白質(zhì)濃度應(yīng)用最廣泛的一種方法。原理：堿性條件下蛋白質(zhì)與Cu2+生成復(fù)合物，還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑生成藍(lán)色化合物，可用比色法測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、蛋白質(zhì)濃度范圍25-250μg/mL缺點(diǎn)：此法實(shí)際上是蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸與試劑的反應(yīng)，因此它受蛋白質(zhì)的氨基酸組成的影響，即不同蛋白質(zhì)中此兩種氨基酸量不同使顯色強(qiáng)度有所差異；此外，酚類(lèi)等一些物質(zhì)的存在可干擾此法的測(cè)定，導(dǎo)致分析的誤差。（7）蛋白質(zhì)含量的測(cè)定蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)雙縮脲法：在堿性條件下，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與Cu2+可生成紫紅色的絡(luò)合物，可用比色法定量。此法簡(jiǎn)便，受蛋白質(zhì)氨基酸組成影響小；但靈敏度不高、樣品用量大，蛋白質(zhì)濃度范圍為0.5-10mg/mLBCA比色法：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+再與BCA試劑(4，4'-二羧酸-2，2'-二喹啉鈉)生成紫色復(fù)合物，于562nm有最大吸收，強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。優(yōu)點(diǎn)：?jiǎn)我辉噭⒔K產(chǎn)物穩(wěn)定，與Lowry法相比幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響。尤其在TritonX-100、SDS等表面活性劑中也可測(cè)定。其靈敏度范圍一般在10-1200μg/mL免疫學(xué)方法(抗原-抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，用于研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)的含量和分布直接免疫熒光技術(shù)(A)：熒光分子與抗體偶聯(lián)后直接用于免疫標(biāo)記間接免疫熒光技術(shù)(B)：先將抗體(一抗)與抗原反應(yīng)，然后加入與熒光分子相偶聯(lián)的抗第一抗體的抗體(二抗)（7）蛋白質(zhì)含量的測(cè)定蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)在超微結(jié)構(gòu)水平上研究特異蛋白抗原的定位分類(lèi)：免疫鐵蛋白技術(shù)、免疫酶標(biāo)技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)A.免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)原理的示意圖：細(xì)菌蛋白A可與膠體金結(jié)合，也可以與抗體(如IgG)的Fc端特異結(jié)合。B.免疫膠體金標(biāo)記膀胱上皮細(xì)胞膜蛋白的分布（箭頭所指）（7）蛋白質(zhì)含量的測(cè)定蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)2、蛋白質(zhì)的分離和分析技術(shù)根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同進(jìn)行分離根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行分離根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離根據(jù)配體特異性進(jìn)行分離（1）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同進(jìn)行分離蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)2、蛋白質(zhì)的分離和分析技術(shù)

利用蛋白質(zhì)溶解度的差異是分離蛋白質(zhì)的常用方法之一。影響蛋白質(zhì)溶解度的主要因素有溶液的pH、離子強(qiáng)度、溶劑的介電常數(shù)和溫度等。在一定條件下，蛋白質(zhì)溶解度的差異主要取決于它們的分子結(jié)構(gòu)；如氨基酸組成、極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)的多少等。因此，恰當(dāng)?shù)馗淖冞@些影響因素，可選擇性地造成其溶解度的不同而分離。鹽析：中性鹽(硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉)硫酸銨分段鹽析效果較優(yōu)，不易引起蛋白質(zhì)變性沉淀分離后需除鹽a、透析法：蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋內(nèi)(玻璃紙)，用緩沖液進(jìn)行透析，不斷更換緩沖液(時(shí)間長(zhǎng)，低溫進(jìn)行)b、柱層析：葡聚糖凝膠G-25或G-50（1）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同進(jìn)行分離蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)2、蛋白質(zhì)的分離和分析技術(shù)等電點(diǎn)沉淀法：等電點(diǎn)狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，溶解度最小，各蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同，調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀（1）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同進(jìn)行分離蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)2、蛋白質(zhì)的分離和分析技術(shù)低溫有機(jī)溶劑沉淀法：乙醇或丙酮去除蛋白質(zhì)的水膜，同時(shí)，將pH調(diào)到蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，蛋白質(zhì)較易變性(分離較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，低溫進(jìn)行)（2）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行分離蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)2、蛋白質(zhì)的分離和分析技術(shù)透析與超濾法透析：利用蛋白質(zhì)分子不能通過(guò)半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)(無(wú)機(jī)鹽、單糖和氨基酸)分開(kāi)超濾法：利用高壓力或離心力，迫使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜，蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的濾膜截留不同Mr的蛋白質(zhì)（2）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行分離蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)2、蛋白質(zhì)的分離和分析技術(shù)凝膠過(guò)濾法：也稱(chēng)分子排阻/分子篩層析大分子沿著凝膠顆粒之