轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)第二部分：分子雜交SouthernBlottingDNA抽提DNA酶切酶切產(chǎn)物電泳轉(zhuǎn)膜烘膜預(yù)雜交探針準(zhǔn)備及標(biāo)記雜交洗膜/顯影1212345679(kb)12335轉(zhuǎn)基因植物拷貝數(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理HindIIIprobe雜交、顯影不同的插入拷貝產(chǎn)生不同大小的雜交帶HHHH酶切、轉(zhuǎn)膜1212345679(kb)12335植物總DNA的快速少量抽提（CTAB法）保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性。（30－50KB）排除其它分子的污染

不存在對(duì)工具酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子。其它生物大分子的污染應(yīng)降到最低程度。DNA純化的要求分離純化核酸總的原則CTAB是一種非離子去污劑，CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（>0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，CTAB-核酸復(fù)合物再用70－75%酒精浸泡可洗脫掉CTAB。CTAB法原理：操作步驟：采取新鮮幼嫩葉片在研缽中用液態(tài)氮冷凍，研磨成細(xì)粉；

取約0.4g左右細(xì)粉于1.5ml離心管，加入1ml預(yù)熱至95oC以上的1.5

CTAB，混勻；

65oC水浴中放置30分鐘，每隔5分鐘上下顛倒混合數(shù)次(DNase變性，促進(jìn)內(nèi)溶物釋放)；

12000rpm離心2分鐘；

吸取600

l上清于新的1.5ml離心管，加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），上下顛倒至下層有機(jī)相呈深綠色；

12000rpm離心5分鐘；吸取450

l上清于新的1.5ml離心管，加入兩倍體積95％乙醇和1/10體積3MNaAc，輕輕地上下顛倒混勻至絮狀沉淀出現(xiàn)；12000rpm離心10分鐘；棄去上清。用500

l

70％乙醇浸洗沉淀5分鐘，除去離子及CTAB殘余，棄上清,自然干燥；加入50

lTE（含20

g/mlRNaseA），放于4oC溶解；充分溶解后，測(cè)定并調(diào)整濃度至250ng/

l（Southern分析常用濃度）；1．盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質(zhì)多，必須用10mM的β-ME處理2．研缽預(yù)凍，粉末轉(zhuǎn)管前至加CTAB前不要融化3．24:1的苯酚氯仿抽提時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕柔，氯仿的操作要在通風(fēng)柜中進(jìn)行4．所用試劑必需滅菌，手套思考：（1）試分析DNA降解的可能原因（2）提高DNA產(chǎn)量的措施本實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

氯仿/異戊醇（24:1）：氯仿是有機(jī)溶劑，去除植物色素，蛋白質(zhì)和多糖等，異戊醇可減少蛋白質(zhì)變性過程中氣泡的產(chǎn)生，配合使用兩有機(jī)溶劑，比用單一有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì)更有效。DNA沉淀：無水或95％的乙醇，異丙醇3MNaAC(或10MNH4AC）協(xié)助乙醇沉淀DNA。75%EtOH去除微量Na+、K+、Mg2+等陽(yáng)離子及小分子量的有機(jī)分子，洗脫CTAB所用到的試劑及作用TE（1mMEDTA，10mMTris.HClpH8.0）溶解并長(zhǎng)期保存DNA。EDTA螯合Mg2+、Ca2+等二價(jià)陽(yáng)離子，從而抑制DNase等的活性。1.5×CTAB

CTAB 15g 1MTris·Cl(pH8.0) 75ml 0.5MEDTA 30ml

NaCl 61.4g AddddH2Oto 1000ml

外環(huán)境條件：pH8.0防止脫氨作用；65℃CTAB中DNase變性，促進(jìn)內(nèi)溶物釋放；離心時(shí)>15℃以防CTAB沉淀而降低DNA量。DNA純度：吸光值檢測(cè)：檢測(cè)260nm、280nm吸光值，紫外分光光度計(jì)A260/A280=1.8－1.9；1.8最佳，低于1.8說明有蛋白質(zhì)，大于1.8說明有RNA。電泳檢測(cè)DNA大小：瓊脂糖凝膠電泳DNA質(zhì)量檢測(cè)Hoechst33258:可與納克級(jí)的DNA結(jié)合，而幾乎沒有RNA親和性，激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)460nm。0.1μg/mlHoechst33258適用于檢測(cè)500ng/ml的DNA濃度，染料增加到1μg/ml，分析范圍可延至15μg/ml，但會(huì)降低一定的靈敏度。缺點(diǎn)：更易于結(jié)合AT豐富區(qū)，對(duì)DNA組成敏感。EB:與DNA組成無關(guān)，但不如Hoechst33258敏感，且能結(jié)合RNA，激發(fā)波長(zhǎng)302nm，發(fā)射波長(zhǎng)590nm。DNA的定量（1）熒光檢測(cè)儀1OD＝50

g/ml DS-DNA或

1OD＝40

g/ml RNAorSS－DNA（2.）分光光度計(jì)瓊脂糖凝膠電泳帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳。電泳的種類多，應(yīng)用非常廣泛，它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。

在pH值為8.0－8.3時(shí)，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)由負(fù)極向正極移動(dòng)。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)像不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測(cè)其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。實(shí)驗(yàn)原理：影響DNA遷移速率的因素

DNA分子大小：遷移速率U與logN成反比（N為堿基對(duì)數(shù)目）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA）瓊脂糖濃度：logU=logU0Kr

膠濃度，U為遷移率，U0

為DNA的自由電泳遷移率，

為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAAgarose： 0.5%：1-30kb； 0.7%：0.8-12kb1.2%：0.4-7kb；1.5%：0.2-3kb.DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時(shí)，情況會(huì)相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。所加電壓：低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm堿基組成與溫度：一般影響不大4-30℃嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度：影響DNA的遷移率，無離子存在時(shí)，核酸基本不泳動(dòng)，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1×TAE，0.5×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）實(shí)驗(yàn)步驟：用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工作臺(tái)上；調(diào)整好梳子的高度；稱取0.24g瓊脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至溫?zé)釙r(shí)倒膠；凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶；將電泳樣品與上樣緩沖液混合后將樣品依次點(diǎn)入加樣孔中；將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動(dòng)（注意點(diǎn)樣孔在電泳槽的負(fù)極一端）；電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入0.5μg/ml的溴化乙錠（EB）中浸泡10－15min，在紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果并照相記錄。電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（bromophenolblue,Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。

1.含甘油或蔗糖，利于DNA樣品沉入點(diǎn)樣孔中2.含有電泳指示劑，以指示電泳的進(jìn)程上樣緩沖液：EB：溴化乙錠，可嵌入DNA分子中，受紫外光激發(fā)而發(fā)出熒光，利用它可檢測(cè)DNA。是誘變劑，可引起插入突變，并有中度毒性，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量減少臺(tái)面污染。1000×貯存液(0.5mg/mL)，使用時(shí)按1：1000稀釋配制染色液。有特定的識(shí)別序列，通常為4－6堿基的回文對(duì)稱序列。切割位點(diǎn)位于識(shí)別序列內(nèi)的固定位置上，切割后在5’末端有磷酸基團(tuán)，3’末端有羥基。切割后形成粘性末端或平末端，前者又分為3’突出端（如PstI）和5’突出端(如EcoRI)兩種其活性發(fā)揮只需Mg2＋作輔酶。II類限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)限制酶的一個(gè)活性單位（1U）：原則上指在50μl反應(yīng)體系中，37℃下，經(jīng)過1小時(shí)的反應(yīng)將1μg的DNA完全分解所需要的酶量。限制酶的star活性：限制酶在某些極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下對(duì)底物DNA的特異性可能降低，即可將與原來識(shí)別的特定DNA序列不同的堿基序列切斷，這種現(xiàn)象叫限制酶的star活性。它的出現(xiàn)的頻率與酶、底物及反應(yīng)條件有關(guān)。引起星星活性的主要因素：高濃度的甘油（>5％）；酶過量（>100U/μg）；低離子強(qiáng)度（<25mM）；高pH(>pH8.0)；有機(jī)溶劑（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；用其他二價(jià)陽(yáng)離子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+)不同的酶對(duì)上述因素的敏感程度不同氯化鎂、氯化鈉/鉀、Tris鹽酸鹽、β－巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）牛血清白蛋白（BSA）典型的限制性內(nèi)切酶作用的緩沖體系成分包括：注意注意閱讀商家提供的產(chǎn)品說明書，了解所使用工具酶的濃度和最適作用條件，不要用錯(cuò)了buffer和作用的溫度等涉及到酶的操作時(shí),一律在冰上操作使用移液器吸取酶時(shí)，tip頭只能剛剛插入液面吸取如果有多個(gè)反應(yīng)，酶、buffer、水等應(yīng)配制成mixture再分裝各種成分加完后應(yīng)混勻，然后在離心機(jī)上短暫離心檢測(cè)DNA質(zhì)量測(cè)量DNA濃度所有DNA樣品的濃度調(diào)整到大致相同限制性內(nèi)切酶操作準(zhǔn)備：DNA(５

g) 7

l10*bufferreaction 2

lEnzyme(10U) 1

l(10U/l)H2O10

l20

l酶切體系：注意：冰上操作1×5×

DNA 7

lHind(10U/μl) 1

l5

l10×buffer 2

l10

lddH2O10

l 50

l Total20

l37°C酶切過夜酶切體系混勻分裝電泳檢測(cè)酶切效率：每樣品1/10量上樣，電泳檢測(cè)。若呈現(xiàn)均勻連續(xù)分布的一片，則酶切效果好，否則重做。出現(xiàn)切爛：DNA降解，重新提DNA；切不動(dòng)：雜質(zhì)多（多糖，蛋白質(zhì)，酚類，有機(jī)溶劑等），重新純化。

酶切效果檢測(cè)：A1優(yōu)總DNAA2劣總DNAB1酶切爛B2酶切優(yōu)B3切不動(dòng)總DNA酶切電泳檢測(cè)1212345679(kb)12335酶切反應(yīng)的終止加入終濃度為12.5mmol/L的EDTA以鰲合鎂離子而終止酶的反應(yīng)多數(shù)酶在65°C10分鐘可被不可逆滅活，少數(shù)65°C不失活的酶在75°C15分鐘也能失活若酶對(duì)熱具完全抗性，可通過酚抽提乙醇沉淀來純化造成DNA酶切不完全的主要原因有：操作不當(dāng)，酶或DNA加至管壁上，反應(yīng)體系沒完全混合；混和后應(yīng)短暫離心；反應(yīng)條件不合適，用錯(cuò)了緩沖液或溫度不合適；酶的活力不夠DNA不干凈，反應(yīng)體系中存在酶的抑制劑；DNA樣品中抑制酶活的污染物主要有：DNA樣品中的蛋白質(zhì)、多糖、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高濃度的鹽等均能抑制酶切活性解決辦法：增加酶作用的單位數(shù)（10-20U/μgDNA)增大反應(yīng)體積以稀釋可能的抑制劑延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間消化基因組DNA時(shí)，加入終濃度1-2.5mmol/L多聚陽(yáng)離子亞精胺可改善酶切效果，其作用是結(jié)合帶負(fù)電荷的污染物。純化DNA膠濃度0.7-0.8%。膠厚度<5mm(<250ml膠)。膠的均一性(不同樣品的遷移率一致)。樣品DNA量指示劑量稍大，長(zhǎng)時(shí)間指示。點(diǎn)樣順序：marker，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，本組樣品電泳電壓：大電泳槽40V，12小時(shí)，1-1.5V/cm。電泳結(jié)束，指示劑約移動(dòng)10-11cm。電泳轉(zhuǎn)膜的方式：

1.UpwardCapillaryTransfer(Figure1) 2.DownwardCapillaryTransfer(Figure2) 3.SimultaneousTransfertoTwoMembranes 4.ElectrophoreticTransfer 5.VacuumTransfer轉(zhuǎn)膜UpwardCapillaryTransferUpwardCapillaryTransferDownwardCapillaryTransfer尼龍膜：高強(qiáng)度，不易破損，與DNA共價(jià)結(jié)合，反復(fù)使用10次以上不破損，不丟失DNA，吸附DNA每cm2比硝酸膜多5倍，50bp有效雜交。硝酸纖維素膜：非共價(jià)結(jié)合，易脆，易丟失DNA，<500bp的DNA無效，不適用于RFLP。

固相支持物的種類及選擇：帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽離子強(qiáng)度（SSC），也可選擇0.4NNaOH硝酸纖維膜：高鹽離子強(qiáng)度促進(jìn)ＤＮＡ與膜結(jié)合（２０×ＳＳＣ），低鹽離子強(qiáng)度導(dǎo)致小片段ＤＮＡ在轉(zhuǎn)移過程中丟失,pＨ>９，ＤＮＡ不能與膜結(jié)合。轉(zhuǎn)移緩沖液（transferbuffer）DNA轉(zhuǎn)移的效率較難判斷，只有在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，通過EB染膠，及分子雜交才可以鑒別效率高低，但已無補(bǔ)救措施，因此，每一步應(yīng)嚴(yán)格操作轉(zhuǎn)膜時(shí)間（durationoftransfer，12hrs）取決于毛細(xì)吸附系統(tǒng)膠厚度(<5mm)及濃度(<1%)ＤＮＡ大小：ＤＮＡ分子量大小決定時(shí)間長(zhǎng)短，部分去嘌呤減小ＤＮＡ，堿轉(zhuǎn)２hrs大部分結(jié)合到膜。尼龍膜（帶正電荷的）具有較大的DNA結(jié)合容量，它能夠吸附變性DNA，核酸能夠不可逆結(jié)合在尼龍膜上。尼龍膜兩邊均有同樣吸附DNA功能(無論用哪邊均可以經(jīng)久耐用，可反復(fù)利用10次以上次），經(jīng)毛細(xì)吸附作用，把DNA從凝膠上轉(zhuǎn)到膜上。DNA轉(zhuǎn)到膜上是復(fù)制膠上的帶型，再在80-100℃真空干燥2hrs，即可固定DNA。操作步驟制膠：注意瓊脂糖的質(zhì)量，膠的濃度，厚度（<5mm）及均一性。一般大電泳槽配制250ml0.8%瓊脂糖凝膠；制樣，點(diǎn)樣：DNA樣品中指示劑量稍多電泳：一般1-1.5V/cm的電壓，使DNA遷移到適當(dāng)距離，一般指示劑約移動(dòng)10-11cm(大電泳槽：40V×12-15hrs，小電泳槽30V×4-5hrs)（一）0.8%瓊脂糖電泳（二）轉(zhuǎn)膜前的準(zhǔn)備

每組2個(gè)合適大小的水盤1根玻璃棒，1塊鏟膠板，1個(gè)切膠刀2張搭鹽橋的濾紙（13cm×35cm)1張合適大小的尼龍膜(7cm×10cm)2張比尼龍膜稍大的濾紙(7.5cm×10.5cm)一疊5cm左右厚的吸水紙(8cm×11cm)1大1小2塊玻璃板試劑：堿轉(zhuǎn)移：0.4MNaOH,0.2NHCl

鹽轉(zhuǎn)移：0.125MHCl;1.5MNaCl/0.5MNaOH1.5MNaCl/0.5MTris;20×SSC鹽轉(zhuǎn)移1凝膠的預(yù)處理:電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當(dāng)大小，切去右上角（最后一個(gè)樣品的最前端）作為電泳方向記號(hào)把凝膠翻面，放入加有足量的0.125M的HCl玻璃盤中，輕輕搖動(dòng)約10min，使電泳指示劑溴酚藍(lán)變?yōu)辄S色為止（脫嘌呤）。倒去HCl溶液，加蒸餾水漂洗凝膠倒去蒸餾水，加入足量變性緩沖液（NaOH/NaCl）淹沒凝膠，輕輕搖動(dòng)變性30min。倒去變性緩沖液，加蒸餾水漂洗倒去蒸餾水，加入足量的中和緩沖液（Tris/NaCl）淹沒凝膠，輕輕搖動(dòng)30min中和。倒去中和液，蒸餾水漂洗20×SSC中平衡10min以上2另一玻璃盤中加入足量的轉(zhuǎn)膜緩沖液(20×SSC)，放上洗凈的玻璃板，用2-3張濾紙放在玻璃板上，兩端浸入轉(zhuǎn)膜液中搭制鹽橋（注意濾紙之間不能有氣泡）3在鹽橋?yàn)V紙上灑些轉(zhuǎn)膜液，立即將膠放在鹽橋上（注意凝膠與鹽橋之間不要有氣泡），膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（即放置吸水紙與鹽橋相接）4小心將膜覆蓋在凝膠上（膜可以先用H2O浸濕，再放到20×SSC中平衡，膜與凝膠之間不要有氣泡，要求一次成功，膜一旦貼到凝膠不能移動(dòng)）5膜上放2張濾紙，濾紙上放不少于5cm厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約350g的重物，轉(zhuǎn)膜過夜注意：

電泳時(shí)最好點(diǎn)上約5μl的地高辛標(biāo)記的marker電泳時(shí)DNA的量不要過大，否則部分降解的DNA片段就會(huì)與探針雜交引起背景很深電泳時(shí)不要將EB加到凝膠或緩沖液中變性和中和步驟中的處理30min可以分成2×15min任何時(shí)候操作尼龍膜時(shí)都要戴著無塵手套用鑷子接觸膜的邊緣轉(zhuǎn)膜完畢，將膜小心取下，20×SSC短暫漂息，用兩張濾紙包住膜，置于真空干燥箱中，80℃固定2h或120℃30min用EB染膠以檢測(cè)轉(zhuǎn)移效果（四）烘膜轉(zhuǎn)膜時(shí)嚴(yán)禁防短路，不要讓吸水紙全部濕透，重物根據(jù)膜的大小從200g-500g不等面積較小的膜可直接放到膠上，如果尼龍膜較大，可以先在水中浸濕再放入20×SSC平衡，轉(zhuǎn)膜后2×SSC短暫漂洗尼龍膜以免雜交時(shí)有背景預(yù)雜交及雜交時(shí)保證buffer覆蓋膜如果尼龍膜要多次探測(cè)，務(wù)必保證在任何時(shí)候都不要讓尼龍膜干燥試劑1

脫嘌呤試劑（0.125MHCl）：

11mlHCl

989ml蒸餾水混勻（室溫下可放置1個(gè)月）2

變性緩沖液(1.5MNaCl,0.5MNaOH)：

87.66gNaCl

20gNaOH加800ml蒸餾水溶解后，定容至1000ml.（室溫下可放置3個(gè)月）

3中和緩沖液（1.5MNaCl,0.5MTris）： 87.66gNaCl 60.5gTrizmabase 800ml蒸餾水溶解后，用HCl調(diào)pH至7.5，定容至 1000ml（室溫下可放置3個(gè)月）4

轉(zhuǎn)膜緩沖液：20×SSC 88.23gTri-sodiumcitrate 175.32gNaCl

加800ml蒸餾水溶解，檢查pH在7-8之間，定容至 1000ml.(室溫下可放置3個(gè)月)1組：準(zhǔn)備濾紙2組：2000ml脫嘌呤試劑（0.125MHCl）, 3組：2000ml變性緩沖液(1.5MNaCl,0.5MNaOH)4-5組：2000ml中和緩沖液（1.5MNaCl,0.5MTris）6-7組：4000ml轉(zhuǎn)膜緩沖液(20×SSC)對(duì)于大的基因組，DNA酶切圖譜憑肉眼是分辨不開的（EB染色），因?yàn)榇笮〔坏鹊姆肿釉诃傊悄z上呈現(xiàn)彌散分布，只有借助標(biāo)記了放射性同位素或其它標(biāo)記的特定的探針與在凝膠上（膜上）的靶DNA雜交，將DNA帶型直接顯色或轉(zhuǎn)換成X光片（或磷屏）上直觀的帶型，從而檢測(cè)到目標(biāo)DNA片段的位置和大小。Southernhybridization1212345679(kb)12335膜上許多沒有DNA分子的地方，存在DNA結(jié)合點(diǎn)，若不在預(yù)雜交時(shí)用一些封閉劑結(jié)合在這些位點(diǎn)上，加入探針后，探針DNA分子將會(huì)結(jié)合在這些位點(diǎn)上，導(dǎo)致雜交背景深。預(yù)雜交的目的是用非特異性DNA分子（鮭精DNA）及其它高分子化合物（封閉劑）將待雜交膜中的非特異性位點(diǎn)封閉，從而減少雜交背景。（Denharts，鮭精DNA含在雜交液中）。預(yù)雜交5×SSC(NaCl，檸檬酸鈉)50mMPB(NaH2PO4，Na2HPO4)5×Denhardt(多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，BSA)2.5mmEDTA（有/無）100ug/mlSSDNA(鮭精DNA)0.1%SDS10%硫酸葡聚糖（dextransulfate）雜交液組成：實(shí)驗(yàn)原理Hi