課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段自學(xué)提綱：知識(shí)回顧：1.DNA分子的結(jié)構(gòu)（外側(cè)、內(nèi)側(cè)、基本單位）；2.DNA復(fù)制過(guò)程和特點(diǎn)；3.PCR技術(shù)概念及應(yīng)用。基本概念：變性、復(fù)性、TaqDNA聚合酶、引物理解PCR技術(shù)的原理掌握PCR技術(shù)的全過(guò)程比較PCR技術(shù)和體內(nèi)DNA復(fù)制的異同點(diǎn)。1、DNA分子的3’

端與5’

端-OH端為3’;磷酸基團(tuán)的末端為5’

。2、DNA分子由兩條反向平行的脫氧核苷酸鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成氫鍵連接而成。解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打開(kāi)DNA雙鏈模板合成子鏈原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸

思考：3、體內(nèi)DNA復(fù)制的條件是什么？體外擴(kuò)增DNA如何提供相似環(huán)境？變性（80-100℃

）Taq聚合酶（耐高溫）15—30個(gè)核苷酸構(gòu)成DNA或RNADNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃

）復(fù)性（緩慢冷卻）4、DNA分子的熱變性原理：變性的目的：復(fù)性的目的：解開(kāi)雙鏈有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ與兩條單鏈的結(jié)合一、PCR技術(shù)的原理利用DNA分子的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合，從而完成體外DAN分子的擴(kuò)增。體外DNA復(fù)制的條件：

四種脫氧核苷酸、耐高溫的聚合酶、引物、模板；緩沖溶液和嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。復(fù)制的方向：子鏈的5’端向3’端延伸。二、PCR的反應(yīng)過(guò)程每個(gè)循環(huán)包括：變性——復(fù)性——延伸

從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物Ⅱ結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。三、實(shí)驗(yàn)步驟：準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方用微量移液器按配方在往微量離心管中加入各組分蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁混合反應(yīng)液離心10分鐘將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好循環(huán)程序進(jìn)行反應(yīng)注意事項(xiàng)：詳見(jiàn)操作提示

四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)DNA含量的測(cè)定：稀釋→對(duì)照調(diào)零→測(cè)定→計(jì)算（公式見(jiàn)P63）波長(zhǎng)260nm處讀數(shù)蒸餾水做對(duì)照50倍PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別：

1.PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要；

2.PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時(shí)會(huì)變性；

3.PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。練習(xí)鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是A古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測(cè)定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)CDNA序列測(cè)定、基因克隆、刑偵破案‘D診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測(cè)定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是A原理簡(jiǎn)單B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐熱性D快速、高效、靈活、易于操作4、做PCR使用的微量離心管、槍頭、緩沖液及蒸餾水使用前必須進(jìn)行的關(guān)鍵步驟是A反復(fù)洗滌B不怕外源DNA污染C高壓滅菌D在—20℃儲(chǔ)存；/幼兒園家具ekn927ach忽然，他大叫起來(lái)：“有了……我做你的腿！”傻子湊過(guò)來(lái)，把拐杖恨恨地扔到一邊，雙手?jǐn)v起我。“蘇院長(zhǎng)，我可以幫著你做……”他攙扶著我的身子讓我做起動(dòng)作來(lái)。伸臂曲臂、上仰搖頭、擴(kuò)胸彎腰……在他的幫助下，我重復(fù)地做著……“好了好了……蘇院長(zhǎng)能站起來(lái)了……”傻子拍著手在我面前歡呼起來(lái)。我失去了平衡慢慢地向一旁倒下，傻子慌亂地跑過(guò)來(lái)，我的整個(gè)身子重重地壓在他的身上。當(dāng)我掙扎著爬起來(lái)的時(shí)候，傻子已是大汗淋漓了……不出我的預(yù)料，當(dāng)天晚上傻子果真病了。高燒到了40℃，滿嘴里說(shuō)著胡話：“壞了壞了……歪了歪了……快跑快跑……嘿嘿嘿嘿……”“傻子——傻子——”我把他緊緊地?fù)г趹牙?。肖燕立即撥通了已院的電話，救護(hù)車很快就來(lái)了。我跟傻子去了已院……三哥仔細(xì)地檢查了傻子的病情后對(duì)我說(shuō)：“是勞累過(guò)度引起的風(fēng)寒，沒(méi)有大礙，打幾天點(diǎn)滴就好了。”我的心里一塊石頭落了地，迫切地對(duì)三哥說(shuō)：“讓他多住幾天，好好待他，傻子是個(gè)懂事的好孩子……”自從傻子進(jìn)了已院，我的鍛煉就沒(méi)有停歇過(guò)。早晨迎接太陽(yáng)，傍晚披著霞光，在老人們的陪伴下自由自在的運(yùn)動(dòng)著。一開(kāi)始，我借助著樹(shù)干、樹(shù)枝的支撐活動(dòng)著自己的上肢和腰部，后來(lái)，漸漸地也能蹲馬步了。晚上，在睡覺(jué)之前，肖燕不厭其煩地給我按摩。有一次，她一邊給我按摩一邊問(wèn)我：“蘇林，說(shuō)句心里話，如果有那么一天，你的腿真的康復(fù)了，你還繼續(xù)開(kāi)你的養(yǎng)老院?jiǎn)幔俊薄澳阏f(shuō)呢？”我反問(wèn)道?！叭藗兂Ｕf(shuō)，嫁漢嫁漢穿衣吃飯……自從你的腿殘疾以來(lái)，家里的里里外外全靠我一個(gè)人支撐著,你隨便說(shuō)說(shuō)，我就干大半天甚至一兩天也干不完。我不是抱怨，你想過(guò)沒(méi)有？我也是五十多歲的人了，哪里有那么多的精力和體力干這么多的活？”她沒(méi)有回答我的問(wèn)題直接跟我攤牌了，“俗話說(shuō)：跟了當(dāng)官的當(dāng)娘子，跟了殺豬的翻腸子。我倒好自己殺豬自己翻腸子……”我愕然了，我知道她說(shuō)的話都是真的！“蘇林，見(jiàn)好就收吧，我們已經(jīng)盡力了……到時(shí)候等把我也累垮了，咱這個(gè)家我看你咋辦……”妻子的擔(dān)心不是沒(méi)有道理的。養(yǎng)老院剛剛有點(diǎn)起色，我就把它交給他人管理……我還真有點(diǎn)舍不得！“肖燕，就說(shuō)我的腿吧，現(xiàn)在剛開(kāi)始有點(diǎn)好轉(zhuǎn)，咱就放棄了，不治了，你想我這一輩子還有站起來(lái)的希望嗎？”“蘇林，你怎么這么固執(zhí)，這根本就是兩碼事！”“好了好了，我不跟你爭(zhēng)，你說(shuō)的事等過(guò)了年我再想想法?！逼拮硬辉僬f(shuō)話，低著頭默默地給我按摩著。我反而覺(jué)得有點(diǎn)不對(duì)勁兒，禁不住問(wèn)她，“怎么不說(shuō)話了呢？”“你不讓別人跟你爭(zhēng)誰(shuí)還敢說(shuō)話？你以為你是誰(shuí)？倒霉蛋！”說(shuō)著，她故意地把我的小腿擰了一下。