細(xì)胞工程實驗課程組成員：楊慈清、李虎、王紅霞、許重潔辦公：3029114新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)實驗教學(xué)中心實驗二細(xì)胞交融技術(shù)與染色體提早凝集標(biāo)本制備實驗一動物細(xì)胞的培育實驗三小鼠MEF豢養(yǎng)層的制備實驗五原生質(zhì)體的分別、純化和活力鑒定實驗四MS培育基的配制和愈傷組織誘導(dǎo)目錄實驗一動物細(xì)胞的培育一、實驗?zāi)康恼莆崭蔁釡缇?、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作。了解化學(xué)消毒法的運用方法。了解傳代細(xì)胞的傳代方法及操作過程，學(xué)習(xí)察看體外培育細(xì)胞的形狀及生長情況及細(xì)胞增殖動力學(xué)測定的方法。二、實驗原理細(xì)胞培育是一種操作繁瑣而又要求非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要使細(xì)胞能在體外長期生長，必需滿足兩個根本要求：一是供應(yīng)細(xì)胞存活所必需的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注不測環(huán)境酸堿度和浸透壓的調(diào)理。二是嚴(yán)厲控制無菌條件。顯微鏡下的培育細(xì)胞三、實驗方法1、玻璃器材的清洗處置方法2、塑料器材的清洗處置方法3、橡皮器材的清洗處置方法4、金屬器材的清洗處置方法5、細(xì)胞的消化傳代方法方法1、玻璃器材的清洗處置方法清潔液浸泡或用2%磷酸三鈉或潔消精浸泡過夜自來水沖10次培育瓶再用三蒸水浸泡過夜晾干包裝滅菌單蒸水洗2次晾干備用備用刷洗浸泡2、塑料器材的清洗處置方法用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡過夜〔單用或交叉處置〕水洗10次單蒸水2次紫外線或輻射滅菌備用三蒸水浸泡過夜晾干刷洗浸泡3、橡皮器材的清洗處置方法5%NaOH煮10′～20′水洗4%鹽酸煮10′～20′單蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干備用水洗8~10次刷洗浸泡金屬器材的清洗處置方法紙擦去外表的油脂洗衣粉煮沸或用1%碳酸氫鈉煮沸15分鐘水洗95%酒精紗布擦干包裝滅菌4、金屬器材的清洗處置方法吸除或倒掉舊培育液參與2mL，無鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉參與1mL消化液〔0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液〕肉眼可察看到“薄膜〞景象時，倒掉消化液繼續(xù)作用2～3分鐘顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時應(yīng)立刻終止消化5、細(xì)胞的消化傳代方法參與完全培育基5mL，用吸管反復(fù)吹打計數(shù)板計數(shù)分瓶培育細(xì)胞的消化傳代方法生長細(xì)胞形狀四、作業(yè)與思索1．簡述細(xì)胞傳代培育的操作程序及本卷須知。2．細(xì)胞培育獲得勝利的關(guān)鍵要素是什么?3．簡述體外培育細(xì)胞的形狀特征及其生長階段。4．繪制細(xì)胞生長曲線圖。5．繪制細(xì)胞分裂指數(shù)圖。實驗二細(xì)胞交融技術(shù)與染色體提早凝集標(biāo)本制備一、實驗?zāi)康慕?jīng)過細(xì)胞交融技術(shù)，初步了解染色體提早凝集標(biāo)本制備原理、方法及間期細(xì)胞三種時相的提早凝集染色體特點。二、實驗原理M期細(xì)胞內(nèi)有某種促進染色體凝集因子，它無種屬特異性，所以在細(xì)胞交融和染色體技術(shù)的根底上，建立了制備染色體提早凝集標(biāo)本的方法。即讓M期細(xì)胞與間期〔I期〕細(xì)胞交融，從而誘導(dǎo)I期細(xì)胞染色質(zhì)提早濃縮成染色體。構(gòu)成的這種染色體稱提早凝集的染色體(PrematurelyCondensedChromosome，PCC)。三、實驗方法1、細(xì)胞交融方法2、PCC誘導(dǎo)和察看搜集1瓶M期細(xì)胞、消化一瓶貼壁細(xì)胞混合離心用Hank’s液洗1次離心棄上清〔吸干〕輕彈使細(xì)胞分散90s后1、細(xì)胞交融方法37℃滴加50％PEG0.5ml〔12滴〕參與2ml1640〔含10％血清〕加一滴秋水仙素〔10μg／ml〕分別在5min、15min、20min察看細(xì)胞交融參與5ml1640洗一次〔不要吹打〕離心細(xì)胞交融90分鐘后離心棄上清參與0.075mol/lKCl8ml混勻37℃25分鐘參與1ml固定液混勻離心棄上清2、PCC誘導(dǎo)和察看加7ml固定液固定20min離心棄上清加0.5ml固定液滴片〔冰、高、烤〕Giemsa染色12min水沖、晾干、鏡檢四、作業(yè)與思索根據(jù)PCC圖像的察看，試闡明對于了解細(xì)胞周期和DNA復(fù)制有什么啟示?簡述細(xì)胞交融的原理。PCC實驗的主要意義是什么？實驗三小鼠MEF豢養(yǎng)層的制備一、實驗?zāi)康?.掌握常用豢養(yǎng)層的制備原理和方法。2.穩(wěn)定細(xì)胞培育相關(guān)的的技術(shù)。二、實驗原理胚胎干細(xì)胞〔embryonicstemcells,ES〕的體外培育要求增殖的同時堅持未分化的形狀，因此，我們要進展體外培育胚胎干細(xì)胞，必需環(huán)境中滿足兩個條件：細(xì)胞生長因子和分化抑制因子。體外培育的成纖維細(xì)胞可以分泌細(xì)胞生長因子和分化抑制因子，前者可以促進ES細(xì)胞的增值，后者可以有效的抑制ES的自主分化。目前，可以用來制造豢養(yǎng)層的細(xì)胞有多種，其中原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞〔mouseembryonicfibroblast,MEF〕取材方便，易于鋪層，分泌才干強而成為ES細(xì)胞首選的豢養(yǎng)層細(xì)胞。

將原代培育的MEF細(xì)胞進展傳代，多為3－6代，這樣不僅可以使得MEF細(xì)胞的純度較高，而且生長形狀也很好。在制備豢養(yǎng)層前將MEF細(xì)胞用絲裂霉素C或射線照射預(yù)處置，抑制DNA的復(fù)制使其在堅持分泌功能的根底上失去增值才干，以免與ES的生長發(fā)生競爭。在詳細(xì)實驗中，MEF細(xì)胞的原代分別時胎齡的選擇，作為豢養(yǎng)層運用時細(xì)胞代數(shù)的選擇，絲裂霉素處置的濃度都會影響豢養(yǎng)層培育體系的質(zhì)量。胎齡過大，那么成纖維細(xì)胞的成分降低，分別效率低下，且易混雜其他細(xì)胞，難以去處。假設(shè)胎齡過小，胚胎形狀小，軀干部分不易分辯，操作困難。細(xì)胞代數(shù)過多，那么出現(xiàn)衰老征象；細(xì)胞代數(shù)過少，不容易純化。絲裂霉素的濃度處置和處置時間直接影響細(xì)胞的形狀。二、實驗方法與步驟1.MEF的獲取：〔1〕激素處置小鼠，同期發(fā)情和超數(shù)排卵〔2〕2：1合籠過夜〔3〕取出有陰道栓的開場記時間為0.5天〔4〕取出妊娠12.5-14.5天的小鼠為實驗資料〔5〕無菌取出胚胎〔6〕去除頭、尾、內(nèi)臟和四肢，僅留軀干部〔7〕用眼科剪刀剪成1mm3組織塊〔8〕0.25%胰蛋白酶消化20min/室溫，每隔5min振蕩一次〔9〕過濾〔200目篩網(wǎng)〕并搜集濾液〔含有單個的MEF〕二、實驗方法與步驟2.接種并進展原代培育〔1〕細(xì)胞計數(shù)，按照1*105個/ml接種于培育瓶中〔2〕48小時換液，4-5天后傳代3.傳代培育〔1〕傳3-5代，并長滿瓶底部，并換液備用于第二天處置4.絲裂霉素C處置細(xì)胞〔1〕用20mg/L和10mg/L以及空白組的絲裂霉素C處置2.5-3.5小時〔2〕棄去含有絲裂霉素C培育液小鼠胚胎成纖維細(xì)胞顯微圖體外培育的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞二、實驗方法與步驟5.沖洗〔1〕PBS沖洗3-6次，去除剩余的絲裂霉素，加常規(guī)培育液，在5天內(nèi)用于步驟66.常規(guī)胰蛋白酶消化，重新接種，貼壁后即可以運用〔1〕常規(guī)胰蛋白酶消化〔2〕單細(xì)胞懸液以1*106個/ml接種于經(jīng)過0.1%明膠處置30min的培育瓶或者培育板中〔3〕貼壁后即可以運用四、本卷須知無菌操作吹打細(xì)胞時要小心，用力均勻用酶消化時留意時間，不可過渡五、作業(yè)與思索1.細(xì)胞計數(shù)，繪制MEF細(xì)胞生長曲線，延續(xù)7天，至少5天。分三個處置20mg/L和10mg/L以及空白組2.做好原代培育任務(wù)，并在48小時換液時和4-5天傳代時，仔細(xì)察看細(xì)胞形狀和生長形狀并記錄結(jié)果，分析產(chǎn)生結(jié)果的緣由。3.設(shè)計細(xì)胞培育室的理想規(guī)劃，并且將儀器配備入內(nèi)。4.掌握細(xì)胞培育過程中的常用方法。5.如何盡能夠的做到無菌操作實驗四MS培育基的配制

和愈傷組織誘導(dǎo)一、實驗?zāi)康慕?jīng)過掌握MS培育基母液配制及常用培育基的制備和滅菌方法，為植物組織培育預(yù)備適宜的營養(yǎng)條件；掌握植物外植體的消毒技術(shù)、離體培育的無菌操作和愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)。二、實驗原理植物資料培育要獲得勝利，并正常生長，培育基的成分是一個決議性要素，不同植物要求不同的培育基。大多數(shù)植物組織培育所用的培育基由無機營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)理物質(zhì)和有機附加物等五類物質(zhì)組成。二、實驗原理由于細(xì)胞的全能性，在適宜的生長條件下，一定濃度的細(xì)胞分裂素和生長素配比可以誘導(dǎo)植物的外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織，為進一步再分化發(fā)明條件。植物細(xì)胞全能性三、實驗資料與器具高壓滅菌鍋、普通及精細(xì)天平、玻璃器皿〔燒杯、1000、500mL容量瓶、移液管、試劑瓶、1000、500、100mL三角瓶〕、化學(xué)試劑。四、實驗步驟

1、配制幾種母液〔1〕配制100倍1LMS大量元素母液NH4NO3

165gKH3PO417gKNO3190g

CaCl2·2H2O

44gMgSO4·7H2O

37g四、實驗步驟

〔2〕配制MS微量元素母液配制成100倍1L母液，母液。依次稱取KI0.083gNa2MoO4·2H2O0.025gH3BO30.62gCuSO4·5H2O

0.0025gMnSO4·H2O

1.69g

CoCl2·6H2O

0.0025gZnSO4·7H2O

0.86g

四、實驗步驟

〔3〕配制MS有機母液普通配制成100倍1LMS有機母液。依次稱取肌醇

10.0g

鹽酸硫胺素

0.01g煙酸

0.05g

甘氨酸

0.20g鹽酸吡哆醇

0.05g四、實驗步驟

〔4〕配制MS鐵鹽母液

普通配制成100倍lLMS鐵鹽母液。依次稱取EDTA二鈉3.73g

FeSO4·7H2O

2.78g四、實驗步驟

2．植物激素的配制0.1mg/mL的6-BA溶液：取25mg的6-BA，用少量1N的鹽酸溶解，再加蒸餾水定容至250mL。0.1mg/mLNAA：取25mg的NAA可溶于熱水中或用少量95%乙醇或少量1N的NOH溶解后，再加水定容至250mL。四、實驗步驟

3．培育基的配制分別汲取母液各10mL及6-BA和NAA母液各20mL，混合后，再加蔗糖至終濃度3%，用NaOH調(diào)理pH至6.0；參與瓊脂6g。最后加蒸餾水定容至于1L。然后用組織培育用封口膜封上，扎緊后滅菌。四、實驗步驟

4．培育基滅菌和分裝將分裝好的培育基放在高壓滅菌鍋中，加熱，待壓力上升到0.5kg/cm2時，排凈冷空氣，封鎖放氣閥繼續(xù)加熱使壓力穩(wěn)定在1.2kg/cm2，溫度為121℃的條件下，維持15~20分鐘。滅菌后的培育基冷卻至65℃左右，分裝，每100mL三角瓶裝40mL，共裝25瓶。四、實驗步驟

5．消毒液的配制次氯酸納消毒液：取30mL次氯酸納溶液，用蒸餾水定容至100mL。現(xiàn)配現(xiàn)用。75%的酒精：75mL的95%的酒精加水定容至95mL。四、實驗步驟

6．外植體的制備和接種將發(fā)芽的零余子用次氯酸納消毒液或者75%的酒精消毒后移入超凈任務(wù)臺的無菌培育皿中，用解剖刀切取苗芽，然后將其接種在培育基上，普通每瓶接種4-5片苗芽?？焖俜夂闷靠?，并寫上接種日期。四、實驗步驟

7．愈傷組織的誘導(dǎo)接種后的三角瓶置于24℃條件下，黑暗培育一周，然后在同樣溫度下分為光照和黑暗培育直至愈傷組織構(gòu)成。五、本卷須知配制鐵鹽母液時，F(xiàn)eS04和Na2EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色(約加熱20

-

30

min)，調(diào)pH值至5.5，防止FeS04結(jié)晶析出。五、本卷須知由于高溫滅菌會降低pH值〔約0.2-0.3個pH值〕，配制時常提高pH值0.2-0.3。接種時嚴(yán)厲留意無菌操作。六、作業(yè)與思索1．植物培育基為什么要分成母液分開配制。2.分析實驗中植物愈傷組織生長所需求的必要條件。實驗五原生質(zhì)體的

分別、純化和活力鑒定一、實驗?zāi)康?.學(xué)習(xí)植物細(xì)胞原生質(zhì)體分別和純化的方法。2.了解原生質(zhì)體活性鑒定的原理。二、實驗原理植物原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁后為原生質(zhì)所包圍的“裸露細(xì)胞〞，是開展根底研討的理想資料。其中，酶解法分別原生質(zhì)體是一個常用的技術(shù)，其原理是植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因此運用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁成分，除去細(xì)胞壁，即可得到原生質(zhì)體。由于原生質(zhì)體內(nèi)部與外界環(huán)境之間僅隔一層薄薄的細(xì)胞膜，必需堅持在浸透壓平衡的溶液中才干堅持其完好性。其次,還該當(dāng)思索取材、酶的種類和純度、酶液的浸透壓、酶解時間及溫度等要素對分別原生質(zhì)體的影響。測定原生質(zhì)體的活性有多種方法。熒光素雙醋酸酯(FDA)染色是常用的一種方法，F(xiàn)AD本身無熒光，無極性，可透過完好的原生質(zhì)膜。一旦進入原生質(zhì)體后，由于遭到酯酶