第7講植物細胞培養(yǎng)制備代謝產(chǎn)物II本節(jié)主要內(nèi)容：1.植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的技術(shù)方法2

2.植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的討論本節(jié)關(guān)鍵問題：影響植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的因素及調(diào)控方法一

代謝產(chǎn)物初級代謝產(chǎn)物（Primary

metabolites）：是通過

初級代謝產(chǎn)生的維持細胞生命活動必需的物質(zhì)，

如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類等。在不同種類

的細胞中，初級代謝產(chǎn)物的種類基本相同。初級

代謝產(chǎn)物的合成無時無刻都在進行著，任何一種

產(chǎn)物的合成發(fā)生障礙都會影響細胞正常的生命活

動，甚至導致死亡。次級代謝產(chǎn)物（Secondarymetabolites）是通過次級代謝合成的產(chǎn)物，大多是分子結(jié)構(gòu)比較復雜的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物堿、毒素等。由于次級代謝產(chǎn)物大多具有生物活性，因此是植物代謝產(chǎn)物研究的重點。二

植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的意義

一個例子：紫杉醇紫杉醇（Taxol）是從紅豆杉屬植物中分離得到的一種雙萜類化合物化。C47H51NO14，

分子量：853.90用途：具有良好的抗癌活性，尤其對晚期、轉(zhuǎn)移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有十分顯著的療效。制備途徑：1.直接從紅豆杉中提取2.化學全合成；化學半合成3.植物細胞培養(yǎng)4.內(nèi)生真菌培養(yǎng)提?。涸诓煌t豆杉屬植物樹種和樹木的不同部位(如樹皮、

木材、樹葉、嫩枝和幼苗等)含量有所不同，以樹皮、嫩

芽中含量最高，心材最低。一般含量為0.005%

左右。生

產(chǎn)1kg紫杉醇需要砍伐60年生大樹3000-4000棵。若光從樹

皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200萬棵左右的大樹。

無法滿足市場需求，破壞寶貴資源、不可持續(xù)發(fā)展。化學合成：結(jié)構(gòu)復雜，全合成需要幾十步合成步驟，總得率僅4-5%。成本高。三

植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物（一）細胞株篩選細胞系(Cell

line)是由原代培養(yǎng)經(jīng)傳代培養(yǎng)純化，

獲得的以一種細胞為主的、能在體外長期生存的

不均一的細胞群體。細胞株(Cell

strain)是指從一個經(jīng)過生物學鑒定的

細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由

單細胞增殖形成的細胞群。

再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株(Substrain)。細胞株和細胞系的區(qū)別1名詞的由來：細胞株（cellstrain）最初為W.Earle（1940）所采用，他把自己建立的小鼠結(jié)締組織L系稱為“株”。1951年，GeorgeGey把其建立的人體宮頸癌細胞Hela系稱為“株”1954年，White另外使用了“系”來稱呼ACarrel培養(yǎng)的雞胚心臟的細胞群2名詞使用的現(xiàn)實情況2．1中學教材定義在人教版高中生物（選修）全一冊第70頁中，細胞株被定義為經(jīng)原代培養(yǎng)的組織細胞，培養(yǎng)到第10代左右，度過第一次死亡危機后的細胞群，這種細胞的遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變；細胞系則被定義為可以度過第二次死亡危機，傳代培養(yǎng)到40~50代的細胞，這部分細胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了部分改變并且細胞帶有癌變的特點，這種細胞在適宜條件下無限傳代。2．2文獻定義由新鮮組織制成的細胞培養(yǎng)物稱原代細胞，這種細胞經(jīng)首次傳代成功后的細胞稱做細胞系，可泛指一般可能傳代的細胞。若用胰蛋白酶等將原代細胞消解分散后，再培養(yǎng)一代，稱次代培養(yǎng)。如果不能繼續(xù)傳代或傳代有限，可稱為“有限細胞系（finitecellline）”或“已建立的細胞系（establishedline）”。能夠連續(xù)傳代的細胞叫做“連續(xù)細胞系或無限細胞系（infinitecellline）”。從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系或原代培養(yǎng)物用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，克隆具有特殊性質(zhì)或標志的單細胞獲得的細胞群，稱細胞株。3比較不同觀點得出的結(jié)論3．1矛盾性：人教版高中生物教材中細胞株和細胞系的概念內(nèi)涵與文獻中的概念內(nèi)涵不同甚至完全相反。人教版高中生物細胞株概念強調(diào)結(jié)束原代培養(yǎng)并可以進行傳代培養(yǎng)的細胞群，并不強調(diào)細胞群的純度；文獻中的細胞株概念強調(diào)細胞群的純度，認為細胞株是克隆的結(jié)果。人教版高中生物細胞系概念強調(diào)這些細胞已發(fā)生部分遺傳物質(zhì)的改變，帶有癌變的可以傳代培養(yǎng)的細胞群；文獻中的細胞系概念強調(diào)細胞系是首次傳代成功后的細胞群。3．2劃分標準人教版高中生物細胞系和細胞株定義以傳代代數(shù)為標志區(qū)分，以遺傳物質(zhì)是否改變?yōu)闃酥?；專業(yè)文獻中這兩個概念與傳代代數(shù)無關(guān)，遺傳物質(zhì)的改變與否并不做要求。細胞株強調(diào)細胞培養(yǎng)物中細胞成分單一性，所有的遺傳、生化等特性完全相同；細胞系不強調(diào)純度，但應該有某一類細胞占絕大數(shù)。細胞株指標（1）分散性好，適合大規(guī)模懸浮培養(yǎng)。（2）均一性好，細胞大小、生理狀態(tài)一致。（3）生長速度快，培養(yǎng)周期短，不易染菌。（4）目標產(chǎn)物含量高，容易分離提取。（5）細胞遺傳穩(wěn)定。適合工業(yè)生產(chǎn)用細胞株的一般篩選流程1.愈傷組織的誘導與培養(yǎng)：選用植物的目標化合物高產(chǎn)部位

作為外植體誘導愈傷組織。愈傷組織形成后，進行繼代

培養(yǎng)。2.單細胞分離：選取生長快速而疏松的愈傷組織，通過固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，挑選生長快速的細胞。3.細胞無性系的分離：轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，從中選擇分散性好、生長速度快的細胞。4.細胞株篩選：檢測目標產(chǎn)物含量，從（3）中選擇目標產(chǎn)物含量高的細胞株。5.性能評價：進行較大規(guī)模培養(yǎng)，考察細胞生長與目標產(chǎn)物合成的穩(wěn)定性。6.細胞株獲得：得到適合工業(yè)化生產(chǎn)的細胞株，保種。細胞株定向富集馴化例如：激素自養(yǎng)型細胞株的篩選馴化：將愈傷組織或分離到的細胞接種在不含生長素、分

裂素的繼代培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)，挑選生長好

的細胞進行反復繼代培養(yǎng)馴化，可以獲得激素自

養(yǎng)型細胞。（二）次級代謝產(chǎn)物生物合成莽草酸途徑：喹啉類、異喹啉類、吡咯啶類、烏頭類、吲哚類、大環(huán)類生物堿等。聚酮途徑：聚酮類化合物。甲戊二羥酸途徑：萜類、甾體。

紫杉醇（雙萜類）生物合成4個異戊二烯——GGPP——19個酶促反應（Bacctin直接前體）、C13側(cè)鏈合成——紫杉醇GGPP產(chǎn)物積累與細胞生長關(guān)系a生長偶聯(lián)型：產(chǎn)物合成發(fā)生在細胞生長過程中，到達平臺期后合成停止。b中間型：產(chǎn)物合成出現(xiàn)在細胞生長旺盛階段，在平臺期也能合成，但是速度減緩。c非生長偶聯(lián)型：產(chǎn)物合成出現(xiàn)在細胞生長平臺期。（三）工藝流程（四）影響次級代謝產(chǎn)物的因素1

1.生物因素（1）細胞株穩(wěn)定、高產(chǎn)、生長速度快的細胞株是細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的前提。在進行植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有價值的代謝產(chǎn)物時必須

弄清楚產(chǎn)物的合成部位，也就是應該考慮到不同

部位來源細胞的特性。缺乏適合的細胞株是目前許多代謝產(chǎn)物無法利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的主要限制之一。（2）細胞凋亡細胞凋亡（Cell

apoptosis），也叫程序性細胞死亡（

Programmed

cell

death，PCD），是機體維持環(huán)境穩(wěn)定

、有基因控制的細胞自主的有序性死亡。細胞凋亡是植物細胞培養(yǎng)過程中不可避免的現(xiàn)象，但是可以通過條件改變進行調(diào)控來減少細胞凋亡。關(guān)鍵是要保證充足的營養(yǎng)供給以及避免有害代謝產(chǎn)物的積累，這可以通過采用合適的培養(yǎng)工藝來實現(xiàn)。（3）細胞團植物細胞容易聚集成團，每個細胞團一般由4-300個

細胞組成，大小因植物細胞種類不同具有較大差

異，例如：煙草細胞團直徑大約在350-1000μm

，長春花細胞團在40-2000μm之間。細胞團的形成影響穩(wěn)定的懸浮體系的維持，同時造

成了培養(yǎng)物的顯著異質(zhì)性，細胞團表面與內(nèi)部的

細胞存在營養(yǎng)吸收和代謝產(chǎn)物分泌的差異。此外

，細胞團容易受剪切力影響而破碎，引起培養(yǎng)液

粘度增加，致使氣體交換與傳遞受到影響。要保

持反應器良好的混合效果。適當大小的細胞團有利于代謝產(chǎn)物積累。（4）生物合成機制次級代謝產(chǎn)物的生物合成不同于蛋白質(zhì)合成，涉及

多基因參與（基因簇），機制非常復雜，影響因

素非常多。結(jié)合目標產(chǎn)物進行生物合成機制研究，揭示代謝途

徑及誘導合成機制是細胞培養(yǎng)的重要生物學問題

，有利于指導建立優(yōu)化的培養(yǎng)工藝與技術(shù)。2.化學因素主要通過合適的培養(yǎng)基選擇來控制，包括營養(yǎng)鹽、前體和調(diào)節(jié)因子等。（1）營養(yǎng)鹽：一方面是保證植物細胞生物量的增長

；另外一方面是要保證細胞能合成和積累次級代

謝產(chǎn)物。普通的培養(yǎng)基一般僅能滿足第一方面的需要，對于

第二方面的需求，必須針對具體的培養(yǎng)對象和目

的，對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，從而保證最大限度地積

聚目標產(chǎn)物。（2）前體（precursor

）指某一代謝中間體的前一階段的物質(zhì)。一般在生物

合成反應的中間過程中，某一階段前的物質(zhì)，都

可以說是該階段物質(zhì)的前體物質(zhì)。缺乏某一種前體時細胞就不能合成某一種代謝物。

如果在培養(yǎng)基中加入外源前體將會有助于合成該

代謝產(chǎn)物或使其產(chǎn)量增加。（3）誘導子狹義誘導子：是指那些能夠與細胞發(fā)生相互作用，通過細胞

內(nèi)一系列的信號轉(zhuǎn)導過程，作用于與細胞次生代謝相關(guān)

的基因表達，進而改變細胞次生代謝相關(guān)酶的活力，最

終使細胞次生代謝水平發(fā)生改變的物質(zhì)。廣義誘導子：是指所有能夠提高細胞次生代謝相關(guān)酶活力，

進而提高細胞次生代謝水平的外界因素。溫度、光照、

紫外線、紅外線等都是廣義誘導子。從來源上可以分為外源性和內(nèi)源性誘導子，后者是指在外界信號刺激下細胞合成的物質(zhì)。從性質(zhì)上可以分為生物與化學誘導子。（4）反饋抑制?植物次級代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)系統(tǒng)的積累有時會對目標產(chǎn)物的合成具有反饋抑制。?例如：直線式反饋控制（Straight

linear

feedback

contro1)

：當末端代謝產(chǎn)物達到

一定濃度時，就會抑制該代謝途徑，通常是抑

制第一種酶的活性。?可以采用流加/半連續(xù)培養(yǎng)、兩相培養(yǎng)等工藝技術(shù)可以克服。在培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培養(yǎng)體系形成上、下兩相，細胞在水相中生長合成次生代謝物質(zhì)，分泌出來的產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移至有機相中。不僅減少了產(chǎn)物的反饋抑制作用，而且實現(xiàn)收獲的連續(xù)化。例如：（1）在紫草細胞懸浮培養(yǎng)時加入十六烷不僅可以原位提取紫草寧色素，而且可以使產(chǎn)量提高。（2）采用對紫杉醇有高分配系數(shù)的十六烷、油酸等進行東北紅豆杉細胞兩相培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇，結(jié)果好于一般懸浮培養(yǎng)，有機相中紫杉醇含量遠高于水相和細胞內(nèi)紫杉醇。（3）在培養(yǎng)的花菱草細胞中加入一種液體硅膠可使血根堿（sanguinarine）產(chǎn)量大幅度提高。3.物理因素主要包括：光照、溫度、通氣、攪拌、pH值等。（1）光照：光對細胞代謝產(chǎn)物的合成有很重要的影

響。光照時間長短、光質(zhì)、光強等都會對代謝產(chǎn)

物合成和積聚產(chǎn)生作用。光對許多酶有誘導或抑

制作用。（2）溫度：溫度會影響酶的活性。細胞的生長速率

與培養(yǎng)溫度緊密相關(guān)。植物細胞培養(yǎng)一般在25℃

左右進行。（3）pH會影響培養(yǎng)液的滲透壓、酸堿度，酶的活性，從而影響細胞代謝。植物細胞液體培養(yǎng)的

pH

變化范圍在

5－6

之間，最佳的起始

pH在5.5－5.8

之間。如果對培養(yǎng)液pH

進行控制，將有利于次級代謝產(chǎn)物的生成。4.工程技術(shù)問題（1）培養(yǎng)液的流變特性由于植物細胞培養(yǎng)過程中容易結(jié)團，同時，不少細

胞在培養(yǎng)過程中容易分泌粘多糖等物質(zhì)，從而使

傳氧速率降低，影響細胞生長。粘度變化可以由細胞本身或其分泌物等引起。前者包括細胞濃度、年齡、大小、結(jié)團情況等。（2）氣體傳遞與微生物不同，植物細胞培養(yǎng)一般需要光照，通過光合作用合成有機物，因此氧氣和CO2的含量與傳遞對培養(yǎng)過程影響較大。氧的傳遞與通氣速率、培養(yǎng)液混合程度、培養(yǎng)液流

變特性、氣液界面面積等因素有關(guān)；而氧的吸收

與反應器類型、細胞生長速率、溫度、pH、營養(yǎng)

組成、細胞濃度等相關(guān)。（3）攪拌與剪切力為了加強氣－液－固之間的傳質(zhì)，細胞懸浮培養(yǎng)時需要混合攪動。植物細胞雖然有較硬的細胞壁，但是細胞壁很脆弱

，對攪拌的剪切力很敏感。由于剪切力比較大，

細胞會自溶，次級代謝產(chǎn)物合成會降低。各種植物細胞耐受剪切力的能力不盡相同。煙草細胞和長春花細胞在渦輪攪拌器轉(zhuǎn)速150

rpm和300

rpm時一般還能生長。培養(yǎng)桔葉雞眼藤細胞時，渦淪攪拌器的轉(zhuǎn)速應低于

20

rpm。剪切力影響的克服可以通過低剪切力的生物反應器開發(fā)與耐受高剪切力的細胞株篩選來實現(xiàn)。（4）泡沫與器壁表面粘附性與微生物細胞培養(yǎng)相比，植物細胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生

的氣泡更大，而且由于培養(yǎng)液含有蛋白質(zhì)或粘多

糖，粘度大，細胞很容易被包埋在泡沫里，造成

非均相培養(yǎng)，也可從營養(yǎng)液中帶出來，造成損失

或污染。因此，必須對泡沫進行消除。消泡劑、機械去除。（五）提高次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑培養(yǎng)設備：選擇或設計合適的生物反應器。培養(yǎng)工藝：誘導子添加、前體喂養(yǎng)、添加競爭途徑

代謝產(chǎn)物抑制劑、培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基、環(huán)境條件

）優(yōu)化與控制、流加培養(yǎng)。培養(yǎng)技術(shù)：固定化培養(yǎng)技術(shù)、兩相培養(yǎng)技術(shù)、兩步

法培養(yǎng)（第1步細胞生長；第2步產(chǎn)物積累）。四

植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的討論（一）水母雪蓮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物雪蓮花。。。花園里種不出天山上的雪蓮花，不經(jīng)歷磨難我找不到今生的幸福。。?！鞍锢珊唾惸四贰保ǖ独桑盎氐嚼_”（鄭鈞）：。。。爬過了唐古拉山遇到了雪蓮花。。。我美麗的雪蓮花。。?！把┥徎ā保ㄐ≈郏骸?。。我思念遠方的家鄉(xiāng)，天山開滿雪蓮花。。?！把┥徎ā保_天蟬）。。。我采了一朵雪蓮花，她是我心中最美麗的花。。。潔白無瑕。。。勤勞的人、純潔的人才配擁有它。。。“遇上你是我的緣”（央金蘭澤）。。。我愛你，就像山中的雪蓮花。。。

雪蓮被視為神物。高山牧民在行路途中遇到雪蓮時，被認為有吉祥如意的征兆，并以圣潔之物相待。雪蓮雪蓮，別名雪荷花。雪蓮花除產(chǎn)于我國西藏外，在我國的新疆、青海、四川、云南也有分布。3000-5000M海拔以上。早在清代,趙學敏著的<<本草綱目拾遺>>中就有以下記載：“大寒之地積雪,春夏不散,雪間有草,類荷花獨莖,婷婷雪間可愛”；“其地有天山,冬夏積雪,雪中有蓮,以天山峰頂者為第一”。藥用價值雪蓮在醫(yī)藥上應用以有數(shù)百年的歷史。我國漢族人民多視為治療風濕關(guān)節(jié)炎之珍品；維吾爾、哈薩克族則當作婦科良藥。印度民間還雪蓮花來治療許多慢性病患者。如胃潰瘍、痔瘡、支氣管炎、心臟病、鼻出血和蛇咬傷等癥。在藏醫(yī)藏藥上雪蓮花作為藥物已有悠久的歷史。藏醫(yī)學文獻《月王藥珍》和《四部醫(yī)典》上都有記載。雪蓮中黃酮類化合物為主要成分。黃酮類化合物以黃酮（2-苯基色原酮）為母核而衍生的一類黃色色素。其中包括黃酮的同分異構(gòu)體及其氫化的還原產(chǎn)物

，也即以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物。類黃酮化合物具有多種生物活性，抗菌、消炎、抗突變、降壓、清熱解毒、鎮(zhèn)靜，在抗氧化、抗癌、防癌等方面也有顯著效果；是大多數(shù)氧自由基的清除劑，對治療冠心病、心絞痛、高血壓等有顯著效果；對降低舒張壓，防治心律失常、心血管病和活血化瘀也起重要作用。?

雪蓮種類繁多,如水母雪蓮、毛頭雪蓮、綿頭雪蓮、西藏雪蓮等。?

水母雪蓮(Saussures

medusa)屬菊科鳳毛菊屬雪兔子亞屬植物。?

自然資源有限，生長條件苛刻，很難人工栽培。?

通過水母雪蓮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮有著重要意義。思考題Q1.作者是從哪幾個方面進行黃酮生產(chǎn)優(yōu)化的?Q2.黃酮積累和細胞生長屬于哪種類型關(guān)系?Q3.接種量大小對細胞生長和產(chǎn)物積累的作用是怎樣的?為什么?Q4.如何解釋聚集體大小與產(chǎn)物積累的關(guān)系?Q5.為什么攪拌生物反應器培養(yǎng)的黃酮產(chǎn)量低于搖瓶培養(yǎng)?生物反應器1攪拌槳選擇對比了傾斜式攪拌槳、透平漿，選著前者。23放大培養(yǎng)產(chǎn)量降低的因素分