(74)專利代理機(jī)構(gòu)上海申浩律師事務(wù)所31280GO1N33/58(2006.01)1%磷酸酶抑制劑的裂解液，冷藏靜置一定時(shí)間1/3頁1/3頁2加入含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的裂解液，冷藏靜置一定時(shí)間后，離心獲取上沖體系內(nèi)的TritonX-100和SDS;所述NP-40裂解液的主要成分為：Tris鹽緩2/3頁2/3頁34 5[0002]磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3,GPC-3)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成員之大小約為66kDa,該蛋白的其他別名包括DGSX,GTR2-2,MXR7,OCI-5,SDYS,SGB,SGBS,SGBS1等。GPC-3由蛋白質(zhì)、糖和脂質(zhì)共價(jià)連接形成復(fù)合物，主要通過糖磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)錨定在細(xì)胞膜外表面，已知的信號(hào)肽位于1-25號(hào)氨基酸carcinoma.Gastroenterology2003;125(1):89-97),在肝癌的惡性進(jìn)展中其表達(dá)水平逐療效果均有臨床意義。生物學(xué)功能研究表明GPC-3以自分泌/旁分泌的方式上調(diào)Wnt信號(hào)通惡性轉(zhuǎn)化(HoM,KimH.Glypican-3:Anewtargetforcancerimmunotherapy.EurJ襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。沉默GPC-3基因的轉(zhuǎn)錄可以抑制裸鼠移植瘤的生長(LiWanget.al,Glypican-3isabiomarkerandatherapeutictargetofhepatocellularcarcinoma,HepatobiliaryPancreatDisInt.2015A泛的靈敏度(56.8%～100%)和特異性(90%～100%),在低分化癌中具有更高的敏感性(TremosiniSetal.Prospective(glypican3,heatshockprofordiagnosisofveryearlyhepatocellularcarcinoma[J].Gut,2012,61(10):1481-品監(jiān)督管理總局頒發(fā)的三類醫(yī)療器械注冊(cè)證【注冊(cè)號(hào)：國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第34015026號(hào)】,已在臨床推廣應(yīng)用。該試劑盒通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)術(shù)后組織樣本GPC-3的表達(dá)，[0006]然而，該試劑盒只能檢測(cè)術(shù)后組織樣本或者有創(chuàng)性檢查的活檢組織樣本，無法實(shí)現(xiàn)血液等體液組織的檢測(cè)，且一次操作耗時(shí)較長，無創(chuàng)性和時(shí)效性難以保證。GPC-3蛋白表達(dá)主要存在于細(xì)胞胞漿內(nèi)，有極少數(shù)GPC-3分泌至細(xì)胞外?，F(xiàn)有針對(duì)血液GPC-3的檢測(cè)方法為ELISA檢測(cè)人外周血血清/血漿，其表現(xiàn)為表達(dá)率偏低，檢出率低，靈敏度低，無法應(yīng)用于[0007]為了實(shí)現(xiàn)血液中GPC-3的有效檢測(cè)，專利號(hào)為CN111593024A的中國發(fā)明專利采用GPC3抗體結(jié)合免疫磁珠捕獲GPC3陽性的CTC,提高肝癌分選效率。但該方法需要先對(duì)血樣進(jìn)將結(jié)合了GPC3抗體的磁微粒緩慢加入，分離捕獲CTC;而后清洗磁球，采用和免疫熒光探針進(jìn)行檢測(cè)。盡管該方法一定程度上實(shí)現(xiàn)了以血液為檢測(cè)基質(zhì)實(shí)現(xiàn)肝癌診斷，但血液的預(yù)處[0008]本發(fā)明針對(duì)血液樣本中GPC-3含量低，難以通過常規(guī)檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的問題進(jìn)行，提供了血液樣本中GPC-3復(fù)合物的富集及檢測(cè)方法，還提供了用于檢測(cè)血液樣本中GPC-3含量的試劑盒。[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：[0010]本發(fā)明第一方面，提供了血液樣本中GPC-3復(fù)合物的富集方法，包含如下步驟：[0012]采集肝癌患者外周血置于抗凝管中，并混勻全血；[0014]加入多倍體積的紅細(xì)胞裂解液，吹打混勻，冰上裂解一定時(shí)間后，離心棄紅色上[0018]加PBS重懸細(xì)胞沉淀，取適量充池，靜置2-3分鐘，通過低倍鏡四角4個(gè)大方格手工白細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下：WBC/L=N/4*10?*104,并計(jì)算每毫升原懸液中的白細(xì)胞數(shù)量，WBC/ml原懸液=N/4*10**稀釋倍數(shù)，當(dāng)白細(xì)胞數(shù)量不低于107時(shí)，進(jìn)入后續(xù)步驟；[0020]特異性磁珠抗體純化分離獲取目的CTC細(xì)胞，獲取的細(xì)胞加入含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的裂解液，冷藏靜置一定時(shí)間后，離心獲取上清液作為待檢測(cè)樣本，實(shí)[0022]紅細(xì)胞裂解液與全血的體積比為6:1,吹打混勻，冰上裂解4～6min后，4℃、400g離心5min后棄紅色上清。78實(shí)現(xiàn)GPC-3富集，富集后能夠通過臨床常用的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)模式或酶聯(lián)免檢測(cè)模式實(shí)現(xiàn)9[0059]圖4為實(shí)施例1血樣預(yù)處理樣本采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。[0060]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但下列實(shí)施例不應(yīng)看作對(duì)本發(fā)明[0061]實(shí)施例血液樣本中GPC-3富集及檢測(cè)[0064]采集肝腫瘤患者外周血置于抗凝管中，并混勻全血[0068]洗滌沉淀1-2次，加入5倍體積的PBS或生理鹽水重懸沉格手工白細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下：WBC/L=N/4*10?*10?,并計(jì)算每毫升原懸液中的白細(xì)胞數(shù)量，WBC/ml原懸液=N/4*10**稀釋倍數(shù)(10)=N/4*10?;[0072]特異性磁珠抗體純化分離獲取目的CTC細(xì)胞，獲取的細(xì)胞加入含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冷藏靜置30min后，離心機(jī)4℃按照14000g、10min離心，獲取上清液作為待檢測(cè)樣本，實(shí)現(xiàn)GPC-3富集。上清液利用BCA總蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣本[0074]2.1化學(xué)發(fā)光檢測(cè)模式建立[0075](1)GPC-3包被抗體按照5μg/mL濃度配制10mL,100μL/孔加入96孔白色高吸附化學(xué)[0077](3)按照150μL/孔加入封閉液(封閉液主要含有1%BSA或酪蛋白或鮭魚精子、10%蔗糖或2%tween20等),室溫放置2h;ml),按照100μL/孔加入制備好的[0081](7)100μL/孔加入生物素標(biāo)記的抗GPC-3抗體工作液(2ug/ml),37℃反應(yīng)60-90min,而后重復(fù)步驟6;還含有10%蔗糖或2%tween20等),室溫放置2h;[0091](7)100μL/孔加入生物素標(biāo)記的抗GPC-3抗體工作液(2μg/ml),37℃反應(yīng)60-[0096]MAGTVRTACLVVAMLLSLDFPGQAQPPPVGEFFTDVSLYILGSDINVDDMVNELFDSLFPVIYTQLMNPGLPDSALDINECLRGARRDLKVFGNFPCN114813266A說明書7/10頁[0105]采用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法對(duì)實(shí)施例及對(duì)比例1和2中的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)品濃度檢測(cè)CLIA值實(shí)施例對(duì)比例1對(duì)比例205濃度(ng/mL)[0115]平行采取十個(gè)肝癌患者外周血，分別按照對(duì)比例1和對(duì)比例2所述方法進(jìn)行處理樣本編號(hào)123456789樣本編號(hào)實(shí)施例檢測(cè)CLIA值12349/10頁56789[0123]表4與表3中的樣本1～7、9存在重疊，相當(dāng)于該八個(gè)樣本分別經(jīng)過實(shí)施例、對(duì)比例和2中的方法進(jìn)行富集。對(duì)比可知，采用本發(fā)明方法進(jìn)行血樣樣本富集預(yù)處理后，GPC-3富集效果增強(qiáng)效果明顯，CLIA值達(dá)到對(duì)比例1的數(shù)倍甚至數(shù)十倍，是對(duì)比例2的3～10倍，效果差異顯著。[0124]二、酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)模式[0126]1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[0127]采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，各標(biāo)準(zhǔn)品的OD值結(jié)果如表5所示：[0128]表5實(shí)施例1標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)05[0130]根據(jù)該結(jié)果繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。[0131]2、實(shí)施例與對(duì)比例對(duì)比[0132]平行采取十五個(gè)肝癌患者外周血，分別按照對(duì)比例1和實(shí)施例所述方法進(jìn)行預(yù)處理后，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表6所示：[0133]表6對(duì)比例1及實(shí)施例樣品檢測(cè)結(jié)果對(duì)比樣本編號(hào)血漿檢測(cè)細(xì)胞裂解液檢測(cè)<110>中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院<120>血液樣本中GPC-3復(fù)合物的富集、檢測(cè)方法及應(yīng)用<130>權(quán)利要求書、說明書MetAlaGlyThrValArgThrAlaCysAspIleAsnGluCysLeGluLeuValAsnGl