實(shí)驗(yàn)四重組克隆的鑒定與融合蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化、分析IdentificationofRecombinedClonesandExpression,Purification,andAnalysisoftheFusionProtein第一天1.小量質(zhì)粒DNA提取2.克隆的空載體DNA和重組DNA限制酶切鑒定3.

選定克隆的菌液的離心處理和凍存內(nèi)容安排第二天1.SDS膠的制備2.純化表達(dá)的6-His融合蛋白3.電泳樣品的制備4.SDS電泳5.瓊脂糖凝膠電泳、鑒定質(zhì)粒酶切產(chǎn)物內(nèi)容安排第三天1.SDS膠的銀染顯示2.13:30~14:30筆試考試3.凝膠的干燥保存內(nèi)容安排質(zhì)粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA原理——堿裂法堿變性法抽提質(zhì)粒是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH12.6的高堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA都發(fā)生變性，但質(zhì)粒超螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離。質(zhì)粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA原理——堿裂法溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁（溶液Ⅰ），十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecylsulfate,SDS）可使細(xì)胞壁裂解。細(xì)菌經(jīng)溶菌酶、陰離子去污劑（SDS）和強(qiáng)堿（溶液Ⅱ），處理后，細(xì)菌DNA纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上。質(zhì)粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA原理——堿裂法當(dāng)以pH4.8的KAc高鹽緩沖液（溶液Ⅲ），調(diào)節(jié)其pH至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，保存在溶液中。而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA原理——堿裂法通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。而質(zhì)粒DNA則留在上清液中，再經(jīng)酒精沉淀、洗滌處理，可得到質(zhì)粒DNA。由于操作原因，提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋?？蛰d體和重組體受體菌質(zhì)粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA質(zhì)粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA操作步驟1.細(xì)菌培養(yǎng)：（實(shí)驗(yàn)老師準(zhǔn)備）取試管數(shù)只（3只），各加入3mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，從轉(zhuǎn)化的細(xì)菌培養(yǎng)皿上分別取單一菌落（2個無綠色熒光；1個有綠色熒光），加入各管中，于37℃150rpm振搖過夜培養(yǎng)。質(zhì)粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA操作步驟2.質(zhì)粒的提?。ㄋ娜艘唤M）（1）取菌液（三種）各1.2mL于小離心管中，10000r/min離心1min去掉上清液。加入150μL的溶液Ⅰ，充分混懸細(xì)菌，在室溫下放置10min。（2）加入200μL新配置的溶液Ⅱ。加蓋，顛倒5次使之混勻。冰上放置5min。質(zhì)粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA操作步驟（3）加150μL冷卻的溶液Ⅲ，加蓋后顛倒混勻，冰上放置15min。10000r/min離心5min，上清液（400μL）轉(zhuǎn)入另一離心管中。（4）向上清液中加入等體積苯酚/氯仿，震蕩混勻，10000r/min離心2min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。質(zhì)粒DNA提取

IsolationofPlasmidDNA操作步驟（5）向上清液中加入等體積無水乙醇，混勻，室溫放置2min。離心5min，去上清，將離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。（6）加1mL70%乙醇，震蕩并離心，倒去上清液，晾干，加入20μL的TE緩沖液，使DNA完全溶解，待用。限制酶切鑒定重組質(zhì)粒

IdentificationofrecombinantPlasmidbyRestrictionDigestion操作步驟1.限制酶切（每組取3只1.5mL離心管）每管反應(yīng)體積20μL，每管加提取的質(zhì)粒DNA液5μL，再加入酶切反應(yīng)混合液15μL?；靹蚝笾?7℃溫浴，酶切過夜。DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒反應(yīng)完畢各加入3μL10×LoadingBufferM12第一組第二組3412341.空載體，2.空載酶切，3.重組體，4.重組體酶切Ion-exchangeChromatographyAffinitychromatography6His標(biāo)簽重組蛋白純化原理重組蛋白質(zhì)中成串組氨酸殘基（一般六個組氨酸殘基相連）可以與金屬鎳螯合物特異結(jié)合，這一特性目前常常被用來進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的純化。6His標(biāo)簽重組蛋白純化原理原核表達(dá)重組蛋白質(zhì)純化，根據(jù)重組蛋白質(zhì)變性與否可分為：非變性純化（nativeconditions）和變性純化（denaturingconditions）；按操作的方法可分為：批純化（batchpurification）和柱純化（columnpurification）。6His標(biāo)簽重組蛋白純化原理此類蛋白質(zhì)純化技術(shù)屬于固化金屬離子親和層析（immobilized-meatalaffinitychromotagraphy，IMAC），利用組氨酸殘基中所含的串聯(lián)咪唑基團(tuán)與固化金屬離子可以螯合形成配位鍵的特性純化重組蛋白；6His標(biāo)簽重組蛋白純化原理先通過固化于基質(zhì)（常用為瓊脂糖）的金屬離子及其載體與帶有6His標(biāo)簽重組蛋白結(jié)合，無6His標(biāo)簽的蛋白理論上不與之結(jié)合，經(jīng)洗脫液洗脫非特異性親和蛋白質(zhì)后；再用高濃度咪唑溶液將帶有6His標(biāo)簽重組蛋白從其結(jié)合的基質(zhì)上洗脫下來，達(dá)到分離、純化重組蛋白質(zhì)的目的。6His標(biāo)簽重組蛋白純化原理Interactionbetweenneighboringresiduesinthe6HistagandNi-NTAmatrix6His標(biāo)簽重組蛋白純化原理Ni-NTA-Agarose6His-tagBindingResin6His標(biāo)簽重組蛋白純化原理6His標(biāo)簽重組蛋白純化原理組氨酸（Histidine）咪唑（Imidazole）ChemicalstructuresofHistidineandImidazole

柱純化（columnpurification）批純化（batchpurification）Purificationof6Histaggedproteinsusingthespincolumnprotocol小量重組蛋白純化用離心套管陽性重組體篩選后培養(yǎng)

（實(shí)驗(yàn)老師準(zhǔn)備）1.選取含陽性重組體的大腸桿菌置于含Amp培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)2.次日，向培養(yǎng)基中加入IPTG至終濃度為1mmol/L，于30℃繼續(xù)培養(yǎng)3h。3.以未加IPTG的細(xì)菌作為未誘導(dǎo)對照。6-His融合蛋白的分離純化

IsolationandPurificationof6-His-Fusionsprotein2.超聲波破裂細(xì)菌（實(shí)驗(yàn)老師準(zhǔn)備）①未加IPTG的細(xì)菌裂解液標(biāo)記為1號管（未誘導(dǎo)）②經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌裂解液標(biāo)記為2號管（誘導(dǎo)）

第二天操作步驟3.His-BindResin柱的預(yù)處理：（實(shí)驗(yàn)老師準(zhǔn)備）在1.5ml離心管中加入100μLHis-BindResin，加入200μLWashingbuffer，10000rpm離心30秒，去上清，重復(fù)2次。每組準(zhǔn)備一只處理好的Ni2+柱，柱體積50μL。平衡后的Ni2+柱移置純化管內(nèi)第二天操作步驟4.6-His融合蛋白的純化1）上樣：將細(xì)菌裂解上清液0.6mL（預(yù)留100μL做蛋白濃度測定及上樣，2號管）轉(zhuǎn)移入處理好的Ni2+柱（50μL柱體積）中，充分混勻10min。（持續(xù)顛倒混勻）將混好的上清液及Ni2+柱轉(zhuǎn)移入純化柱中，10000rpm，30秒，收集濾出的液體（標(biāo)記為3號管）。第二天操作步驟2）清洗非特異性結(jié)合蛋白：將純化柱套入收集管中。在柱內(nèi)加入（5倍柱體積）500μLWashingbuffer，劇烈震蕩，10000rpm，30秒，收集濾出的液體（標(biāo)記為4號管）。再重復(fù)洗兩次，收集濾液標(biāo)記為5、6號管第二天操作步驟3）洗脫靶蛋白將純化柱分別套入新的1.5mL離心管中。在柱內(nèi)各加入200μLElutebuffer，指彈混勻室溫放置5min，10000rpm，30秒，收集濾出的液體（標(biāo)記為7號管,即純化靶蛋白）。第二天操作步驟5.樣品準(zhǔn)備1號管蛋白樣品通過定量后，大膠上樣量60μg，小膠上樣量30μg；2號管大膠70μg，小膠上樣量35μg；3至7號管上樣體積與2號管相等，加入4×上樣buffer混勻。95℃加熱10min，為電泳樣品。第二天操作步驟除電泳分離膠濃度增加至12%外，其他步驟同前。（參照實(shí)驗(yàn)一）凝膠厚度統(tǒng)一為：1mmSDS電泳膠制備第二天操作步驟SDS電泳膠制備1.膠模準(zhǔn)備與灌膠：配分離膠（12%）：取一個100ml燒杯，加入以下成分:第二天操作步驟

分離膠緩沖液（pH8.8）2.5mL40%丙烯酰胺膠液3mLH2o4.4mL10%過硫酸銨0.1mL輕搖混勻后，8μLTEMED，再次混勻后立即加入玻板中。P.85.表2-19，10ml/塊膠第二天操作步驟壓縮膠濃度（5%）

壓縮膠緩沖液（pH6.8）1.25mL40%丙烯酰胺膠液0.625mLH2o3.075mL10%過硫酸銨50mL輕搖混勻后，8μLTEMED，再次混勻后立即加入玻板中。P.85.表2-19，5mL/塊膠SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2.上樣電泳：40-50V電壓電泳過夜。第二天操作步驟1號2號3號Marker4號5號6號7號LoadingbufferLoadingbufferSilverstainingstocksolutions第三天操作步驟第三天操作步驟第三天操作步驟第三天操作步驟第三天操作步驟蛋白質(zhì)電泳膠的銀染色顯示方法

Silver-StainingDisplayofProteinElectrophoresisGel操作步驟：（注意：進(jìn)行任何操作時，手都不可以觸及膠面，必須戴手套，只能接觸凝膠溴酚藍(lán)前沿部分，避免手指紋污染蛋白質(zhì)膠面）

1、固定漂洗：待電泳完畢，關(guān)閉電源，斷開連接導(dǎo)線；傾去電極液，卸下膠膜；取下分離膠膠塊浸泡入5體積（50ml）蒸餾水，快速漂洗后，加入5體積的Silverstainingfixingsolution振搖30min，速度以膠塊略微浮起為好；（步驟1,2等待期間瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切質(zhì)粒）第三天操作步驟2、致敏：去除固定液，用5體積的Sensitizingsolution，振搖30min；3、漂洗：加入5體積的蒸餾水，振搖5分鐘，去除液體后重復(fù)2次漂洗；4、染色：加入5體積Silversolution，振搖20min（避光）。5、再漂洗：加入5體積的蒸餾水，振搖1分鐘，去除液體后重復(fù)1次漂洗；第三天操作步驟6、顯色：加入5體積Developingsolution，振搖至膠塊中色帶清楚，（一般10min以上，顯色時間依水的純度不同而有差異），而背景略呈淡黃色；7、終止：立即傾去顯色液體，加入5體積Stoppingsolution終止反應(yīng)。照相或干膠保存結(jié)果。第三天操作步驟實(shí)驗(yàn)預(yù)做結(jié)果質(zhì)粒DNA過夜酶切第三天實(shí)驗(yàn)預(yù)做結(jié)果1.1號管（未誘導(dǎo)）；2.2號管（誘導(dǎo)過柱前）；3.3號管（過柱后）；4.Marker；5-7.4號，5號，6號管（washbuffer清洗非特異結(jié)合蛋白）；8.7號管（elutebuffer洗脫靶蛋白）背景知識目的基因pKCε部分片段1.1kb實(shí)驗(yàn)原理蛋白激酶C

目前為止，在哺乳動物組織內(nèi)已確定10種PKC亞類，分為A、B、C三組，A組稱為典型或傳統(tǒng)的PKC（classicalorconventionalPKC,CPKC），包括α、βI、βⅡ和γ亞類，其中βI和βⅡ有高度的同源性，是由同一mRNA的不同剪接而成，A組成員分子量在76-78kDa。B組為新型PKC（atypicalPKC,aPKC），包括δ、ε、η（L）和θ亞類，分子量在77-83kDa。C組為非典型PKC（atypicalPKC,aPKC），由ζ和λ亞類組成，分子量較小為67kDa。實(shí)驗(yàn)原理哺乳動物組織內(nèi)的PKC亞類亞

類氨基酸殘基分子量（kDa）激

活

劑表達(dá)組織A組：經(jīng)典PKC

α67276PS、Ca2+、DAG、FFA、LysoPC廣泛βI67176同

上某些組織βⅡ67376同

上多種組織γ69778同

上腦B組：新型PKC

δ67377PS、DAG廣

泛ε73783PS、DAG、FFA腦

等η（L）68377？肺、皮膚、心臟θ70781？骨骼肌C組：非典型PKC

ζ59267PS、FFA廣

泛λ58667？卵巢、睪丸等實(shí)驗(yàn)原理載體pUC18-GFP：3.4kbGFPampr實(shí)驗(yàn)原理重組體pUC18-GFP-pKC：4.5kbGFPpKCεampr6-HisUAG6-HispKC表達(dá)產(chǎn)物：融合蛋白（40KD)實(shí)驗(yàn)原理HindⅢ12435酶切鑒定的原理重組體上有3個HindⅢ的酶切位點(diǎn)正向：1+2(1.3kb)；3+4(430)；5反向：1+3(790)；2+4(950)；5空載：1+4(620)；5實(shí)驗(yàn)原理1（490）；2（820）；3（300）4（130）；5（2.7kb）綠色熒光蛋白（GFP)

綠色熒光蛋白-發(fā)現(xiàn)日本科學(xué)家下村脩1962年在普林斯頓大學(xué)做研究的時候，從一種特殊水母中提取水母素時，偶然發(fā)現(xiàn)一種在紫外光下可以發(fā)強(qiáng)烈綠色的蛋白─綠色熒光蛋白(GFP)。發(fā)光原理其基因可在異源組織中表達(dá)并產(chǎn)生熒光，GFPcDNA開放閱讀框架長度約714bp，編碼238個氨基酸殘基，其肽鏈內(nèi)部第65-67位絲氨酸－脫氫酪氨酸－甘氨酸通過自身環(huán)化和氧化形成一個發(fā)色基團(tuán)，在長紫外波長或藍(lán)光照射下發(fā)出綠色熒光。實(shí)驗(yàn)原理GFP的優(yōu)點(diǎn)

(1)易于檢測。GFP熒光反應(yīng)不需要外加底物和輔助因子，只需紫外光或藍(lán)光激發(fā)，即可發(fā)出綠色熒光，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到，且靈敏度高，對于單細(xì)胞水平的表達(dá)也可識別。

(2)熒光穩(wěn)定。GFP對光漂白有較強(qiáng)的耐受性，能耐受長時間的光照GFP在pH7~12范圍內(nèi)也能正常發(fā)光；對高溫(70℃)、堿性、除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)都有較強(qiáng)抗性?！?/p>

(3)無毒害。從目前的研究結(jié)果來看，GFP對生活的細(xì)胞基本無毒害，對目的基因的功能也沒有影響，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞仍可連續(xù)傳代。實(shí)驗(yàn)原理GFP的優(yōu)點(diǎn)(4)通用性。表現(xiàn)在GFP的表達(dá)幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動物中都獲得了成功的表達(dá)；其次是GFP沒有細(xì)胞種類和位置上的限制，在各個部位都可以表達(dá)發(fā)出熒光。(5)易于構(gòu)建載體。由于GFP分子量較小，僅為27~30kD，編碼GFP的基因序列也很短，為2．6kb，所以很方便地同其它序列一起構(gòu)建多種質(zhì)粒，而不至于使質(zhì)粒過大影響轉(zhuǎn)化頻率。實(shí)驗(yàn)原理(6)可進(jìn)行活細(xì)胞定時定位觀察。對活細(xì)胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真實(shí)的狀態(tài)。通過GFP可實(shí)時觀察到外界信號刺激下，目的蛋白的變化過程，借助于近來廣泛使用的激光掃描共聚焦顯微鏡，結(jié)合強(qiáng)大的計算機(jī)軟件，可進(jìn)行三維顯示。(7)易于得到突變體。GFP中氨基酸的替換可產(chǎn)生不同光譜特性的突變體，且增強(qiáng)了熒光強(qiáng)度，適合在不同物種中專性表達(dá)實(shí)驗(yàn)原理GFP的應(yīng)用

研究基因表達(dá)的調(diào)控元件和蛋白定位。

?研究基因表達(dá)的時序控制與空間定位。

?發(fā)育分子機(jī)理研究。GFP可以作為活體標(biāo)記，在原位觀察細(xì)胞的生長和運(yùn)動。特別對于身體透明的動物觀察起來更方便。

?篩選藥物。由于可以用不同顏色的GFP衍生物標(biāo)記相關(guān)的蛋白，來觀察單細(xì)胞內(nèi)相互作用的靶蛋白，再分離出目的細(xì)胞，從而可用于大規(guī)模藥物篩選。