1非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒和豬非典型瘟病毒鑒別檢測(cè)多重RT-PCR和qRT-PCR方法本文件規(guī)定了用于鑒別檢測(cè)非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒和豬非典型瘟病毒的多重RT-PCR和qRT-PCR方法，包括縮略詞、試劑、主要儀器設(shè)備、操作步驟及結(jié)果判定等技術(shù)要求。本文件適用于非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒和豬非典型瘟病毒的鑒別檢測(cè)診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18648-2020非洲豬瘟診斷技術(shù)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求SN/T5335-2020非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全操作技術(shù)規(guī)范3縮略語下列縮略語適用于本文件。ASFV：非洲豬瘟病毒（Africanswinefevervirus）CSFV：豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus）APPV：豬非典型瘟病毒（Atypicalporcinepestivirus）RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction）qRT-PCR:實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Real-timeRT-PCR）Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)量達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Cyclethreshold）4試劑4.1引物探針引物序列見附錄A，上游、下游引物的使用濃度均為20pmol/μL。4.2RNA/DNA提取試劑盒宜選取商品化的病毒RNA/DNA提取試劑試劑盒。4.3PCR和qRT-PCR擴(kuò)增試劑應(yīng)按照不同的PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)的說明書選取推薦的PCR和qRT-PCR擴(kuò)增試劑。4.4其他試劑宜選取商品化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、T4連接酶試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和電泳緩沖液。5主要儀器設(shè)備生物安全柜、普通PCR儀、熒光PCR儀、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、電熱恒溫水槽、混勻器、組織勻2漿機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、微量移液器。6操作步驟6.1操作環(huán)境以下操作應(yīng)在生物安全I(xiàn)I級(jí)及以上防護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)、無RNA酶的環(huán)境下進(jìn)行。6.2待檢樣品處理6.2.1無菌采取病豬肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等共約5g，置于2.0mL離心管中，加入滅菌的1mol/LPBS（pH7.2）1mL，用組織勻漿機(jī)充分研磨后，反復(fù)凍融3次；以10000×g離心5min，收集上清，用于RNA/DNA抽提，或置-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.2血清樣品直接用于RNA/DNA抽提，或置-20℃保存?zhèn)溆谩?.3待檢樣品RNA/DNA提取取200μL待檢樣品于無RNA/DNA酶的1.5mL離心管中，按照RNA/DNA提取試劑盒操作說明書抽提總RNA/DNA。6.4反轉(zhuǎn)錄(RT)提取樣品總RNA后，以樣品總RNA為模板，按下列反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：5×RT緩沖液4μLAMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）0.5μLdNTP混合物（各10mM/L）1μLRNA酶抑制劑（40U/μL）0.5μL隨機(jī)引物6聚體（50pmol/μL）1.5μL待檢總RNA模板5μL滅菌雙蒸水補(bǔ)足總體積至50μL加完試劑后瞬時(shí)離心混勻。將PCR反應(yīng)管置于普通PCR儀內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃,10min；48℃,45min；95℃,5min。獲得的cDNA直接用于多重PCR擴(kuò)增，或置-20℃保存?zhèn)溆谩?.5多重PCR擴(kuò)增6.5.1反應(yīng)體系的配置反轉(zhuǎn)錄后，以獲得的cDNA/DNA為模板,建立25μLPCR反應(yīng)體系。在冰浴條件下，在PCR反應(yīng)管中按下列用量分別加入各成分：2×TaqPCRMasterMix12.5μLAPPV上、下游引物（20pmol/μL）各0.4μLCSFV上、下游引物（20pmol/μL）各0.4μLASFV上、下游引物（20pmol/μL）各0.4μLcDNA/DNA模板5μL滅菌雙蒸水補(bǔ)足總體積至25μL6.5.2PCR反應(yīng)加完試劑后瞬時(shí)離心混勻。將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)，設(shè)置如下反應(yīng)參數(shù)：94℃2min；然后94℃30s，55℃30s,72℃45s,循環(huán)40次；最后72℃10min。PCR產(chǎn)物直接用于電泳，或置4℃保存?zhèn)溆谩?.6多重qRT-PCR6.6.1反應(yīng)體系的配置反應(yīng)配置應(yīng)在專門的區(qū)域進(jìn)行。采用25μL反應(yīng)體系，擴(kuò)增體系配制如下：PremixExTaq聚合酶12.5μL3APPV上、下游引物（20pmol/μL）CSFV上、下游引物（20pmol/μL）ASFV上、下游引物（20pmol/μL）ASFV-p72-P探針(20pmol/μL)0.5μLCSFV-5'UTR-P探針(20pmol/μL)0.4μLAPPV-5'UTR-P探針(20pmol/μL)0.3μL樣品cDNA/DNA滅菌雙蒸水6.6.2qPCR反應(yīng)在熒光PCR儀上選用TexasRed、JOE和FAM通道，設(shè)置如下反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95℃20s；然后40個(gè)循環(huán)（95℃5s；59℃34s在每次循環(huán)的Red、JOE和FAM通道的熒光信號(hào)。6.7陰性及陽性對(duì)照6.7.1陰性對(duì)照用滅菌雙蒸水作為陰性對(duì)照。6.7.2陽性對(duì)照用重組質(zhì)粒p-ASFV、p-CSFV和p-APPV混合物作為陽性對(duì)照，重組質(zhì)粒p-ASFV、p-CSFV和p-APPV的制備方法見附錄C。7結(jié)果判定7.1多重RT-PCR結(jié)果判定7.1.1瓊脂糖凝膠制備稱取1.5g瓊脂糖加入到100mL1倍電泳緩沖液，煮沸溶解瓊脂糖，冷卻至約50℃時(shí)，加入10mg/mL的瓊脂糖凝膠10μL，充分混合后倒入水平的已插入合適梳子的凝膠盤中，凝膠厚度控制在3mm~5mm之間。待凝膠充分凝固后，拔出梳子，將凝膠連同托架一起放入電泳槽中，加入1倍電泳緩沖液，使之沒過凝膠表面2mm，以備加樣電泳。7.1.2加樣將5μLPCR產(chǎn)物與1μL加樣緩沖液混合均勻，加入一個(gè)瓊脂糖凝膠樣品孔中。每次電泳應(yīng)加陽性和陰性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且設(shè)立DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作為分子質(zhì)量大小的對(duì)照。7.1.3電泳條件以100V穩(wěn)壓進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)離瓊脂糖凝膠末端2cm~3cm時(shí)停止。7.1.4電泳結(jié)果判定7.1.4.1將電泳后的瓊脂糖凝膠用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。當(dāng)陰性對(duì)照無任何擴(kuò)增帶，而陽性對(duì)照在828bp、529bp和275bp位置出現(xiàn)擴(kuò)增帶，則試驗(yàn)結(jié)果成立；否則，此次檢測(cè)無效。7.1.4.2若被檢樣品在828bp位置出現(xiàn)DNA擴(kuò)增帶，判定為ASFV陽性，記為ASFV（+若被檢樣品在828bp位置未出現(xiàn)擴(kuò)增帶，判定為ASFV陰性，記為ASFV（-）。7.1.4.3若被檢樣品在529bp位置出現(xiàn)擴(kuò)增帶，判定為CSFV陽性，記為CSFV（+若被檢樣品在529bp位置未出現(xiàn)擴(kuò)增帶，判定為CSFV陰性，記為CSFV（-）。7.1.4.4若被檢樣品在275bp位置出現(xiàn)擴(kuò)增帶，判定為APPV陽性，記為APPV（+若被檢樣品在275bp位置未出現(xiàn)擴(kuò)增帶，判定為APPV陰性，記為APPV（-）。7.2多重qPCR結(jié)果判定47.2.1結(jié)果分析條件設(shè)定閾值設(shè)定根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。7.2.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)7.2.2.1陰性對(duì)照樣品Ct值≥37。7.2.2.2陽性對(duì)照樣品的Ct值均應(yīng)<28，并出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。反之，此次檢測(cè)無效。7.2.3結(jié)果描述及判定7.2.3.1若被檢樣品出現(xiàn)ASFV的特異性擴(kuò)增曲線，且Ct值≤30，判定為ASFV陽性；反之，判定為ASFV陰性。7.2.3.2若被檢樣品出現(xiàn)CSFV的特異性擴(kuò)增曲線，且Ct值≤30，判定為CSFV陽性；反之，判定為CSFV陰性。7.2.3.3若被檢樣品出現(xiàn)APPV的特異性擴(kuò)增曲線，且Ct值≤30，判定為APPV陽性；反之，判定為APPV陰性。5（規(guī)范性）引物序列、擴(kuò)增片段及結(jié)果判定A.1ASFV、CSFV和APPV特異性引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表A.1。表A.1引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度ATCCGCCGGCACTCTATCAA.2ASFV、CSFV和APPV多重RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖見圖A.1。圖A.1ASFV、CSFV和APPV多重RT-PCR產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖6（規(guī)范性）引物探針及結(jié)果判定B.1ASFV、CSFV和APPV引物探針序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見表B.1。表B.1引物探針序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度GGCGTATAAAAAGTCCAGGATexasRed-TCACCAAATCCTTTTGCGATGCAAGCTJOE-TTCGACGTGAGCAGAAGCCCAGGCACTCTATCAAGCAGTAAGFAM-TCGGGTCCACCATGCCCCTTTB.2ASFV、CSFV和APPV多重qRT-PCR反應(yīng)曲線圖見圖B.1。圖B.1多重qRT-PCR擴(kuò)增曲線圖7（規(guī)范性）重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備C.1特異性引物特異性引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見附錄A中的表A.1。C.2病毒核酸提取及RT-PCR擴(kuò)增取ASFV臨床陽性樣品，按4.3提取總DNA；分別取APPV臨床陽性樣品和CSFV疫苗C株病毒液，按6.3提取總RNA后，按6.4進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT），獲得cDNA。以DNA為模板，應(yīng)用ASFV-F/R引物對(duì)，建立50μL反應(yīng)體系；或以cDNA為模板，分別利用CSFV-F/R、APPV-F/R引物對(duì)，建立50μL反應(yīng)體系。按6.5中的反應(yīng)程序進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物。C.3重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳、用凝膠成像系統(tǒng)觀察后，按膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物。按T4連接酶試劑盒說明書將PCR產(chǎn)物連接到pMD-18T載體，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB/Amp+/X-gal/IPTG平板上，37℃培養(yǎng)16h~18h。挑選陽性菌落，増菌培養(yǎng)后，按質(zhì)粒