細胞因子的檢測方法左大明zdaming@細胞因子

一類由細胞分泌，具有多種功能的高活性小分子蛋白，參與免疫調(diào)節(jié)和多種生理病理過程等。

白細胞介素(interleukin,IL)干擾素(interferon,IFN)腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)生長因子(growthfactor,GF)趨化因子(chemokine)優(yōu)點：敏感、可靠；缺點：需長期飼養(yǎng)細胞、檢測耗時長、步驟繁雜。1不同的CK具有不同的生物學活性，選擇CK獨特的生物學活性，即可檢測。細胞增殖/抑制實驗細胞病變抑制實驗細胞毒實驗細胞趨化實驗。。。生物學檢測法細胞因子的檢測方法2利用抗體對抗原表位的識別，測定的是可溶性細胞因子的抗原性。ELISARIAFIAELISPOT。。。免疫學檢測法優(yōu)點：方便、迅速缺點：價格昂貴，結(jié)果僅代表CK的量而非活性，敏感性較低。3利用基因探針，檢測特定細胞因子基因表達，即mRNA水平。斑點雜交Northern印跡細胞和組織原位雜交RT-PCR。。。分子生物學檢測法局限性：僅能檢測基因表達情況，不能直接提供有關(guān)細胞因子的濃度和活性，只用于機制探討。待檢樣品(細胞上清)指示細胞〔CTLL-2〕IL-2依賴細胞系按不同稀釋度參加37oC，16-20小時參加3HTdR〔1-5Ci〕37oC，4-6小時收集細胞測定細胞增殖實驗細胞病變抑制實驗待檢樣品〔細胞上清〕IFN-指示細胞〔wish〕按不同稀釋度參加37oC，4小時37oC，24-48小時棄取上清，參加VSV(水泡性口炎病毒)觀察細胞病變〔鏡檢或比色〕UsingCFSEtotrackCMLprogenitorproliferationSDMSDM+GlivecCalculationofProliferativeIndex(P.I.)CFSE--->43210TheProliferativeIndexisthesumofthecellsinallgenerationsdividedbythecalculatednumberoforiginalparentcells.Itisusefulforcomparingquantityofcelldivisionbetweenculturesofthesamecellsundergoingdifferenttreatments.CellProliferationELISAKit,BrdU(colorimetric)Chromium-51(51Cr)releaseassays

計數(shù)受趨化細胞趨化因子細胞趨化實驗示意圖微孔濾膜用示蹤物質(zhì)標記抗體或抗原，使其與相應(yīng)的抗原或抗體反響，使微量的、不可見的反響成為可見的或可測定的。免疫標記技術(shù)高通量細胞因子檢測CBA(CytometricBeadArray)是一種微珠多用途檢測分析技術(shù)，它由一系列的微珠組合來捕獲并結(jié)合流式細胞儀技術(shù)檢測細胞培養(yǎng)液、EDTA血漿、血清樣本中被檢測物質(zhì)的量。其采用夾心法分析策略，與傳統(tǒng)的ELISA分析技術(shù)相比，此方法可以同時檢測多項指標。用的標準品和對照標準曲線就可以得出被測樣本的濃度。此分析方法不受樣本量的限制，而且可以得到一個樣本的多個數(shù)據(jù)。CytokinenetworkCBA原理示意圖LabInvest2003,83:1131–1146cytokinebeadarrays(CBA)ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點實驗)ELISPOT技術(shù)利用結(jié)合在固相載體上的抗細胞因子的特異性抗體，在分泌細胞周圍直接撲獲待檢細胞因子。實驗中每個斑點〔spot〕是激活的淋巴細胞分泌的細胞因子區(qū)域，代表一個活性淋巴細胞。它可在單細胞水平檢測淋巴細胞對特異性抗原的反響能力。優(yōu)點：靈敏度高，是目前為止最靈敏的檢測技術(shù)?？蓹z測到百萬分之一陽性細胞率;單細胞水平、活細胞功能檢測;操作簡便，可進行高通量篩選。1.特異性單抗包被在培養(yǎng)板孔底部；2.封閉能結(jié)合單抗的其他部位；3.參加細胞及刺激物培養(yǎng)，陽性細胞分泌的細胞因子被單抗捕獲；4.移出細胞，洗滌；5.參加生物素標記的二抗；6.參加酶標鏈霉親和素；7.參加顯色底物，在酶的催化分解下，產(chǎn)生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑點；8.斑點計數(shù)〔可人工計數(shù)，也可用自動讀板儀計數(shù)〕，數(shù)據(jù)處理，結(jié)果分析。ELISPOT應(yīng)用移植研究--allograftrejection疫苗開發(fā)--亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響Th0/Th1/Th2細胞轉(zhuǎn)換分析自體免疫研究--免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究癌癥研究--腫瘤反響T細胞作用過敏機制探討--IL-4誘導(dǎo)免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參與過敏機制之細胞因子的研究傳染疾病研究--Lymedisease,Chlamydiainfections,Helicobacterpyloriinfections,HIVinfections,multiplesclerosis,等MediumPHAPeptide1Peptide21Peptide47GzBHIV-peptiderecallpatientBIFN-gHIV-peptidespecificrecallresponseshowsdissociatedproductionofIFN-gandGzBKleenT.etal,AIDS2003,18:383-392ELISPOT和ELISA的區(qū)別ELISPOT法源自ELISA，又突破傳統(tǒng)ELISA法，是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的開展，它們最大的不同:1.ELISA通過顯色反響，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量(整體水平);ELISPOT也是通過顯色反響，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率〔單細胞水平〕；

2.ELISPOT比ELISA更敏感。ELISPOT技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：自身免疫診斷和預(yù)后分析、器官移植后排斥反響的預(yù)測、過敏性疾病脫敏治療的監(jiān)測、疫苗和藥品的研發(fā)與檢測等。胞內(nèi)細胞因子的檢測LPS活化單核細胞內(nèi)TNF-α的測定

R1：淋巴細胞；R2：單核細胞TNF-

的誘生和檢測主要由單核/巨噬細胞及其他多種細胞產(chǎn)生，能使殺傷腫瘤細胞;THP-1(人單核細胞系)在LPS(脂多糖)刺激下可分泌TNF-;L929(小鼠成纖維細胞)可被THP-1分泌的TNF-殺傷，且細胞的死亡率與TNF-活性成正比;四甲基偶氮唑鹽(MTT)在活細胞線粒體的琥珀酸