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文檔簡介

實驗十生防細菌

的鑒定及抗菌能力測定2010.05.11

實驗目的生防細菌的純化培養(yǎng)生防細菌的分子鑒定生防細菌的抗菌譜及抗菌能力測定實驗原理和步驟生防細菌的純化培養(yǎng)抗菌譜的測定準備

粗篩分離得到的生防細菌需要在平板上劃線分離，直至分純出單菌落。每組包扎培養(yǎng)皿1包（每包不少于6個）將單菌落生防菌按照圖示，在培養(yǎng)基一側(cè)接種成為一條直線，置于30℃培養(yǎng)備用。Day2生防細菌的液體搖瓶培養(yǎng)抗菌譜的測定挑取劃線分離得到的一個生防菌的單菌落，接種于10mL培養(yǎng)基三角瓶，置于30℃搖床培養(yǎng)備用。將待測菌按照圖示，在垂直于生防菌培養(yǎng)物一側(cè)分別接種大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌，置于30℃培養(yǎng)箱備用。每組準備小包裝1.5mL離心管、藍色白色黃色槍頭若干生防細菌的分子鑒定

16SrDNA是編碼原核生物核糖體RNA小亞基16SrRNA的基因，與細菌整個基因組的變化相比，它具有高度的保守性，其變化的概率與細菌的變異和進化程度是一致的，所以有助于細菌的鑒定和分類。結(jié)合完善的數(shù)據(jù)庫，16SrDNA序列分析可以快速準確的對細菌進行種屬鑒定，確定細菌在進化中的位置。16SrDNA序列包含10個可變區(qū)和與之相間的11個恒定區(qū)。根據(jù)恒定區(qū)的保守性可以設計出細菌的通用引物，并且擴增出所有細菌的16SrDNA片段?？勺儏^(qū)因細菌而異，能夠揭示生物物種特征核酸序列，是種屬鑒定的分子基礎。（二）細菌的16SrRNA分子鑒定反應體系：在一個PCR管中用微量移液槍依次加入：

Taqbuffer（10×）

5ulMgCl21uldNTP

2.5ulPrimerK1+K2

2ulddH2O

39ul用滅菌小槍頭挑取單菌落于PCR管中，使菌體懸浮于反應體系中。rTaq（2U/ul）

0.5ulPCR反應條件：95℃預變性5min后，95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共25個循環(huán)，72℃延伸10min。

抗菌譜結(jié)果觀察生防菌抗菌能力測定

觀察抗菌譜平板。評價生防菌對三種待測菌的拮抗性能。每組制3塊敏感菌的混菌牛膏蛋胨培養(yǎng)基平板。0.1mL的敏感菌菌液；倒入融化好的牛膏蛋胨培養(yǎng)基（不燙手）并輕輕搖晃混勻，冷卻為平板。用記號筆將平板劃分為4個區(qū)域取1mL生防菌菌液，于1.5mL離心管中。8000rpm離心5分鐘用滅菌小濾紙片均勻地吸足上清放在敏感菌混菌平板上。將平板置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h

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