1DB53/TXXXX—2021純種綠孔雀鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了純種綠孔雀（Pavomuticus）鑒定技術(shù)的形態(tài)鑒定、分子鑒定。本文件適用于綠孔雀的純種鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T30989-2014高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程GB/T35892實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南3術(shù)語(yǔ)和定義GB/T30989界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1物種鑒定Speciesidentification通過(guò)形態(tài)特征、分子鑒定，確定檢測(cè)樣本是否為純種個(gè)體的過(guò)程。3.2基因組Genome一種生物體具有的所有遺傳信息的總和。[來(lái)源：GB/T30989-2014，3.2]3.3參考基因組序列Referencegenomesequence通過(guò)對(duì)某個(gè)物種的基因組進(jìn)行從頭測(cè)序，利用生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行拼接、組裝，而獲得的基因組序列信息。3.4基因組重測(cè)序Genomeresequencing針對(duì)有參考基因組序列的物種的不同個(gè)體進(jìn)行基因組測(cè)序，以獲取個(gè)體或群體間的差異性信息。3.5小片段基因組文庫(kù)Small-insertgenomiclibrary片段大小在1kb以下的普通DNA文庫(kù)（200bp、350bp、500bp等），可用于基因組重測(cè)序。4形態(tài)鑒定4.1鑒定材料2DB53/TXXXX—2021供鑒定的個(gè)體應(yīng)為綠孔雀亞成體或成體。4.2鑒定內(nèi)容鑒定內(nèi)容見(jiàn)表1。表1綠孔雀形態(tài)學(xué)鑒定內(nèi)容4.3形態(tài)特征4.3.1整體性狀4.3.1.1個(gè)體較大，雄性體重3850g～5000g，雌性體重1060g～1160g，體羽主要呈金翠綠色。4.3.1.2雄鳥(niǎo)頭頂具一簇直立的冠羽，下背具閃耀紫輝的銅錢狀花斑；尾屏發(fā)達(dá)，長(zhǎng)可達(dá)1m，羽端有一閃耀藍(lán)色和翠綠色相嵌的眼狀斑；尾羽黑褐色，形短而隱于尾屏下；初級(jí)覆羽和初級(jí)飛羽棕黃色。4.3.1.3雌鳥(niǎo)無(wú)尾屏，初級(jí)飛羽外翈有黑色橫斑，背羽多呈黑褐色而密布棕褐色斑紋，羽色也較淡鈍，不如雄鳥(niǎo)艷麗。4.3.2冠羽性狀4.3.2.1冠羽顏色：羽緣具翠綠色寬緣，中央呈輝藍(lán)色。4.3.2.2冠羽形狀：簇狀。4.3.2.3羽枝結(jié)構(gòu)：羽軸兩側(cè)由羽基至頂端均著生羽小枝。4.3.3頰部性狀4.3.3.1眼周裸皮呈淺鈷藍(lán)色，頰部裸皮呈淺鈷黃色。4.3.3.2眼先雄性藍(lán)黑色，雌性棕褐色。4.3.4頸胸背性狀頸胸部及上背部呈金銅色的銅錢狀花斑，羽基暗紫藍(lán)色，常展露于外，羽緣閃翠綠色。4.4綠孔雀與藍(lán)孔雀性狀差別綠孔雀與藍(lán)孔雀整體形態(tài)對(duì)比參見(jiàn)附錄A圖A.1。綠孔雀與藍(lán)孔雀之冠羽、頰部以及頸胸背性狀對(duì)比見(jiàn)附錄A圖A.2。4.5疑似綠孔雀?jìng)€(gè)體形態(tài)鑒定將待檢個(gè)體與純種綠孔雀按4.3、4.4條要求進(jìn)行逐一觀察、比對(duì)及記錄，全部性狀符合純種綠孔雀形態(tài)學(xué)特征，判定為疑似綠孔雀。5分子鑒定3DB53/TXXXX—20215.1鑒定材料經(jīng)形態(tài)鑒定為疑似綠孔雀或無(wú)法進(jìn)行形態(tài)鑒定的個(gè)體的血液、羽毛樣品等。5.2鑒定原理綠孔雀與藍(lán)孔雀（Pavocristatus）存在顯著的基因組水平遺傳分化，可通過(guò)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)待檢樣品基因組中兩物種的遺傳組成貢獻(xiàn)率判斷其種質(zhì)資源狀況。5.3樣品采集5.3.1樣品采集中的動(dòng)物福利應(yīng)符合GB/T35892的要求。5.3.2血液采集使用一次性真空采血管（添加EDTA-K2）采血50μL～100μL。血樣短期保存于-20℃冰箱，長(zhǎng)期保存于-80℃冰箱。5.3.3血液不可獲取時(shí)，可用無(wú)菌塑膠手套收集自然脫落飛羽、尾羽或尾上覆羽等。剪取如圖1所示的羽根部分，短期保存于-20℃冰箱，長(zhǎng)期保存于-80℃冰箱。圖1用于DNA提取的羽毛部分示意圖5.4DNA制備可采用傳統(tǒng)DNA提取方法（參見(jiàn)附錄B中B.1）或商業(yè)試劑盒提取DNA，常用試劑和儀器參見(jiàn)附錄C，用于建庫(kù)的DNA宜符合如下要求：a)使用1%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)（DNA完整性膠檢測(cè)見(jiàn)附錄B中B.2）檢測(cè)DNA完整性，凝膠電泳條帶清晰且應(yīng)在2kb以上（如圖2示例）；b)使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度（檢測(cè)方法參見(jiàn)附錄B中B.3在260nm和280nm的紫外線吸收值比值（OD260/280）在1.8～2.0之間，濃度不低于50ng/uL，總質(zhì)量不低于34DB53/TXXXX—2021圖2瓊脂糖凝膠電泳DNA條帶示意圖注：其中M代表DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，1～6代表待檢DNA樣品。圖中DNA主帶5.5基因組重測(cè)序開(kāi)展DNA樣品的小片段基因組文庫(kù)構(gòu)建（即建庫(kù)）和測(cè)序，技術(shù)要求應(yīng)符合GB/T30989的要求。選擇兩端序列對(duì)讀（即雙端測(cè)序）模式。上述建庫(kù)和測(cè)序可送至商業(yè)公司開(kāi)展。為保證分析質(zhì)量，每待檢個(gè)體總測(cè)序原始數(shù)據(jù)量不低于5Gbp，去除接頭序列以備后需分析。5.6參考基因組選擇在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇已發(fā)布最新版本的純種藍(lán)孔雀基因組（如GenBank訪問(wèn)號(hào)：GCA_005519975.1）和純種綠孔雀基因組（如GenBank訪問(wèn)號(hào)：GCA_016647715.1）作為參考基因組。5.7純種鑒定可采用開(kāi)源軟件sppIDer，分別計(jì)算和統(tǒng)計(jì)待檢個(gè)體基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中比對(duì)到純種綠孔雀和藍(lán)孔雀參考基因組成分的比例。當(dāng)藍(lán)孔雀的基因組貢獻(xiàn)率低于1%時(shí)，軟件判定待檢個(gè)體為純種綠孔雀?jìng)€(gè)體。當(dāng)藍(lán)孔雀的基因組貢獻(xiàn)率高于1%時(shí)，軟件判定待檢個(gè)體為非綠孔雀純種個(gè)體，鑒定結(jié)果模板參見(jiàn)附錄D。5DB53/TXXXX—2021（資料性）藍(lán)孔雀和綠孔雀性狀對(duì)比圖圖A.1綠孔雀與藍(lán)孔雀整體形態(tài)對(duì)比注：引自DanielGiraudElliot,1872.AmonographofthePhasianidae,or,Fami圖A.2綠孔雀與藍(lán)孔雀的冠羽、面部以及頸胸背部性狀對(duì)比注：引自DanielGiraudElliot,1872.AmonographofthePhasianidae,or,Fami6DB53/TXXXX—2021（資料性）DNA樣品的提取與檢測(cè)B.1使用傳統(tǒng)方法提取血液或羽毛DNAB.1.1取5μL～10μL血液或1～3個(gè)來(lái)自同一個(gè)體的羽根于1.5mL離心管中。如是羽根，使用滅過(guò)菌的眼科剪剪碎。B.1.2加入500μL于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液（配方為：100mMTris-HCl，5mMEDTA，500mMNaCl，1%SDS，pH8.0混勻懸濁液。B.1.3向裂解產(chǎn)物中加入20μL蛋白酶K溶液（10mg/mL混勻后，放入恒溫混勻儀于1000rpm混勻頻率和55℃消化3h以上，但不要超過(guò)10h。B.1.4將消化液溫度降至室溫，加入200μL醋酸鉀溶液上下顛倒搖晃20s左右，使其充分混合。B.1.5放入普通高速離心機(jī)中13000rpm離心5min，使蛋白/SDS復(fù)合物沉淀。B.1.6將上清轉(zhuǎn)移到另一干凈1.5mL離心管中，加入600μL異丙醇，充分混合，用13000rpm離心5min收集DNA沉淀。B.1.7倒去上清，加入500μL70％乙醇溶液，顛倒管子數(shù)次，用13000rpm離心3min。B.1.8倒去上清，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上敞口放置3min～10min促使殘余乙醇揮發(fā)。B.1.9將DNA沉淀溶解于50μL～100μL雙蒸水中，吸取5μL用于瓊脂糖凝膠檢測(cè)和核酸定量檢測(cè)，其余轉(zhuǎn)入-20℃保存。B.2DNA完整性膠檢測(cè)B.2.1用雙蒸水洗凈制膠模板和梳子，調(diào)節(jié)水平，放在制膠平板上，向電泳槽中倒入1XTAE電泳緩沖液，其量以沒(méi)過(guò)電泳槽0.2cm為宜。B.2.2稱取1g瓊脂糖與100mL1xTAE緩沖液，加入到配膠用的三角燒瓶?jī)?nèi)，旋轉(zhuǎn)搖晃均勻。B.2.3微波爐內(nèi)加熱2.5min，取出后加入一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液。B.2.4倒入膠槽，加入梳子，室溫下放置30min至凝膠完全凝結(jié)，小心向上拔出梳子，將凝膠預(yù)浸在電泳槽內(nèi)，靜置2min至加樣孔內(nèi)無(wú)氣泡。B.2.5使用移液器取1μLDNA樣品，與1μL6×loadingbuffer混勻后，加入凝膠的加樣孔內(nèi)。B.2.6接通電泳儀電源，保證加樣孔的一端朝向負(fù)極，150V恒壓運(yùn)行20min～40min，loadingbuffer中溴酚藍(lán)代表的片段大小為300bp，電泳中保證該指示劑不要泳動(dòng)出凝膠。B.2.7電泳完畢，關(guān)閉電源，在凝膠成像儀紫外模式下觀察電泳帶及其位置，并與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker比較以判斷DNA樣品的完整性。B.3DNA純度和濃度測(cè)量B.3.1本文件采用的紫外分光光度計(jì)為NanoDrop2000，若用其它品牌和型號(hào)的儀器，分析步驟請(qǐng)參考具體說(shuō)明書(shū)。B.3.2啟動(dòng)NanoDrop2000配套軟件，設(shè)置檢測(cè)樣品為“核酸”，進(jìn)入檢測(cè)界面。B.3.3命名樣品ID，設(shè)置樣品類型為DNA，使用雙蒸水作為空白液進(jìn)行基線校準(zhǔn)。B.3.4使用濾紙擦凈空白液，依次檢測(cè)DNA樣品。7DB53/TXXXX—2021B.3.5測(cè)量結(jié)束后，將測(cè)量參數(shù)輸出到表格，使用雙蒸水和濾紙清潔3～5次，并關(guān)閉軟件。8DB53/TXXXX—2021（資料性）試劑及儀器設(shè)備C.1主要試劑C.1.150xTAE緩沖液(Tris-醋酸鹽-EDTA)：一種核酸電泳緩沖液，主要用于DNA的瓊脂糖凝膠電泳。主要成分為Tris-乙酸鹽（濃度40mM）和EDTA（濃度1mM）?？芍苯佑秒p蒸水稀釋50倍至工作濃度（1×)使用。C.1.2核酸熒光染料：用于凝膠成像顯示條帶。C.1.36xLoadingBuffer：瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液，可以顯示兩條帶，前面的藍(lán)色條帶是溴酚藍(lán)，代表的片段大小是300bp，后面的綠色條帶是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。C.1.4蛋白酶K溶液：用于核酸與蛋白質(zhì)的分離，濃度為10mg/mL。C.1.53M醋酸鉀溶液：取60mL的5mol/L醋酸鉀，加11.5mL冰醋酸，加雙蒸水稀釋至100mL，PH4.8。C.1.6異丙醇：分析純級(jí)。C.1.770%乙醇溶液。C.1.8雙蒸水：ddH2O。C.1.9瓊脂糖。C.1.10細(xì)胞裂解緩沖液：100mMTris-HCl，5mMEDTA500mMNaCl，1%SDS,pH8.0。C.1.11蛋白酶K。C.1.12SDS：十二烷基硫酸鈉。C.1.13DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker：100bp～2000bp。C.2儀器設(shè)備C.2.1單道可調(diào)式移液器（如，最大量程分別為3μL，20μL，200μL，1000μ