ICS11.220

B41

備案號：62057-2019DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3094—2018

種豬場歐洲型豬藍耳病凈化技術(shù)規(guī)范

Thetechnicalspecificationsforremovingeuropeangenotypeporcinereproductive

andrespiratorysyndromeinbreedingpigfarm

DB21/T3094—2018

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則并起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省畜牧獸醫(yī)局提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：錦州醫(yī)科大學(xué)、遼寧省動物衛(wèi)生監(jiān)測預(yù)警中心、錦州市動物疫病預(yù)防控制中心等

單位。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李冰、劉全、高慎陽、劉英姿、陳勇、李寧、張建平、馬強、趙巖、田苗、張

娜、夏偉、邵奎龍、路暢、李紅偉、郭雪峰、孫洪廣、劉宏艷、李強、劉曉宇、王軍、徐暢、何禮。

II

DB21/T3094—2018

種豬場歐洲型豬藍耳病凈化技術(shù)規(guī)范

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了種豬場歐洲型豬藍耳病凈化的術(shù)語和定義、檢測方法與判定標(biāo)準(zhǔn)、凈化群的建立、凈

化群的維持、凈化場的認定和凈化場的維持。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于種豬場歐洲型豬藍耳病凈化工作。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T27517鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經(jīng)典毒株復(fù)合RT-PCR方法

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB16548病害動物和病害動物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程

NY/T1168畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

3.1歐洲型豬藍耳病

歐洲型豬藍耳?。‥uropeanGenotypePorcineReproductiveandRespiratorySyndrome；

EU-PRRS）：由歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起豬的一種高度接觸性傳染病，該病不但引起豬只免

疫抑制，母豬流產(chǎn)，也可引起仔豬死亡，同時影響高致病性豬藍耳病的防控工作，是世界上危害養(yǎng)豬業(yè)

最嚴(yán)重的傳染病之一。

3.2可疑感染豬群

可疑感染豬群（Suspiciouslyinfectedswineherd）：未發(fā)現(xiàn)任何癥狀，但與患病豬群及其污染

的環(huán)境有過明顯接觸的豬群，稱為可疑感染豬群。

3.3假定健康豬群

假定健康豬群（Hypothesisofhealthyswineherd）：除了患病豬群和可疑感染豬群外，疫區(qū)其

他易感豬群都屬于假定健康豬群。

4凈化群的建立

4.1采樣數(shù)量和采樣時間

4.1.1假定健康豬群

1

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種公豬按100%比例采血，或同時按100%比例采集精液，連續(xù)采集2次，間隔14天。種母豬按25%比例

采血，或同時采集活體扁桃體，連續(xù)采集2次，間隔14天。

4.1.2可疑感染豬群

種公豬、種母豬分別按100%比例采血，或同時按100%比例采集精液，連續(xù)采集2次，間隔14天。

4.1.3感染豬群

種公豬、種母豬、后備豬分別按100%比例采血，或同時按100%比例采集精液，連續(xù)采集2次，間隔

14天。

4.2檢測方法

4.2.1檢測試劑和儀器

本技術(shù)規(guī)范中使用的試劑，除另有說明外，所用試劑均為分析純；所有試劑均用無RNA酶的容器分

裝，水為符合GB/T6682-1992標(biāo)準(zhǔn)的滅菌雙蒸水或超純水。

本技術(shù)規(guī)范中需應(yīng)用下列試劑和材料：Trizol（RNA抽提試劑，外觀為粉紅色，分裝至棕色瓶中，

于4℃～8℃保存）、氯仿（4℃預(yù)冷）、異丙醇（4℃預(yù)冷）、75%乙醇（用新開啟的無水乙醇和DEPC水

配制，－20℃預(yù)冷）、DEPC水（1000mL雙蒸水中加入1mLDEPC，室溫下持續(xù)攪拌過夜，121℃高壓滅菌

25min）、RNA酶抑制劑（40U/μL）、TaqDNA聚合酶（5U/μL）、dNTP(2.5mmol/L)、AMV反轉(zhuǎn)錄酶（5

U/μL）、三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液（TAE）、溴化乙錠（EB）、DL2000DNAMarker、上游引

物：5ˊ-TAACCGAGCATACGCTGTGAGAAAG-3ˊ，下游引物：5ˊ-CAAATTAACTTGCACCCTGACTGGC-3ˊ。

本技術(shù)規(guī)范中使用的設(shè)備包括：PCR擴增儀，高速冷凍離心機（離心力在12000g以上），核酸電泳

儀和水平電泳槽，組織均漿機或研缽，凝膠成像系統(tǒng)、微量移液器。

4.2.2樣品的采集與處理

4.2.2.1組織樣品：按照GB/T27517標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于組織樣品處理方法執(zhí)行。采集時應(yīng)釆取有明顯病變的

淋巴結(jié)、扁桃體、肺臟、脾臟、腎臟、胸腺等組織樣品。用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品0.5g左右

于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加0.3mL～0.5mLPBS混勻，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無菌

Eppendorf管中，4℃條件下5000r/min離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入新的無菌Eppendorf管中，編號備用。

4.2.2.2血清或抗凝血：用無菌注射器自耳靜脈或前腔靜脈釆集血液3mL～5mL，待血清析出后直接吸

取血清至無菌Eppendorf管中，血清量不少于0.5mL，編號備用；用無菌注射器先吸入抗凝劑（阿氏液）

2mL～3mL，再自耳靜脈或前腔靜脈采集等量血液快速混勻后轉(zhuǎn)入無菌Eppendorf管中，編號備用。

4.2.2.3存放與運送：采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，盡快運送到實驗室。采集或

處理的樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍

融。

4.2.2.4RNA提取及cDNA合成：按照Trizol提取試劑說明書提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進

行轉(zhuǎn)錄合成cDNA，－20℃保存待檢。

4.2.2.5RT-PCR擴增

2

DB21/T3094—2018

表1RT-PCR反應(yīng)體系（總體積25μL）

反應(yīng)體系最佳劑量

DEPC水13.5μL

2.5mmol/LdNTP2μL

10μmol/L上游引物1μL

10μmol/L下游引物1μL

25mmol/L氯化鎂溶液1.5μL

10倍PCR緩沖液2.5μL

5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL

cDNA3μL

總體積25μL

反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3min；變性94℃30s，退火溫度58℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；總延伸

72℃10min。

4.2.2.6電泳：將PCR擴增產(chǎn)物8μL與2μL上樣緩沖液混合，加樣于1%瓊脂糖凝膠孔中，瓊脂糖凝

膠板一側(cè)點樣孔加入DL2000MarkDNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物。以5V/cm電壓電泳30min，用紫外凝膠成像

儀觀察結(jié)果。

4.2.2.7結(jié)果判定

被檢樣品電泳出現(xiàn)519bp擴增帶為歐洲型PRRSV陽性，詳見圖1。

圖1歐洲型PRRSV陽性毒株P(guān)CR電泳圖

注：M,DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000Marker）；1,陰性對照；2,PRRSV歐洲型毒株陽性對照。

4.3處理

歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測陽性者，應(yīng)淘汰處理。在最后1頭陽性豬淘汰后3個月，對種公豬按100%

比例、母豬按25%比例采血或同時按相同比例采集活體豬扁桃體樣品，再次進行歐洲型豬藍耳病病毒核

酸檢測。歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測全部陰性，可視為假定歐洲型豬藍耳病陰性豬群。

3

DB21/T3094—2018

5凈化群的維持

5.1日常檢測

每年對假定歐洲型豬藍耳病陰性種豬群進行3～4次抽檢。每次采集血清或活體扁桃體樣品，抽樣比

例為存欄種豬的25%～35%。應(yīng)在連續(xù)12個月內(nèi)，對所有6月齡以上種豬每頭至少進行1次歐洲型豬藍耳病

病毒核酸檢測，檢測方法按本技術(shù)規(guī)范建立的方法執(zhí)行。

抽樣復(fù)查如歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測出現(xiàn)陽性，應(yīng)重新對種豬群開展凈化，確保種豬群歐洲型

豬藍耳病病毒核酸陰性。

5.2后備豬的檢測

選留的后備豬在轉(zhuǎn)入種豬群前，進行歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測，確保轉(zhuǎn)入種豬群的豬只歐洲型

豬藍耳病病毒保持陰性，樣品采集、檢測方法及處置同4.1、4.2和4.3檢測方法。

5.3引進豬只的檢疫

對引進豬只嚴(yán)格進行檢疫、隔離，確保引進豬只沒有歐洲型豬藍耳病病毒感染和帶毒，檢疫方法按

4.1、4.2和4.3執(zhí)行。

5.4病死豬的檢測

收集病死豬及母豬所生產(chǎn)的弱仔豬、死胎、流產(chǎn)胎兒，進行歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測，檢測方

法同4.2。如若檢出歐洲型豬藍耳病病毒核酸陽性，應(yīng)重新對種豬群開展凈化。

6凈化場的認定

種豬場應(yīng)符合下列所有條件，即達到歐洲型豬藍耳病凈化標(biāo)準(zhǔn)。

1)種豬場連續(xù)12個月對所有6月齡以上種豬至少進行2次病原學(xué)監(jiān)測，監(jiān)測結(jié)果為陰性。

2)有監(jiān)測證據(jù)表明在過去12個月內(nèi)豬群沒有出現(xiàn)歐洲型豬藍耳病臨床病例。

7凈化場的維持

7.1引進豬只的檢疫

按照《跨省調(diào)運乳用、種用動物產(chǎn)地檢疫規(guī)程》(農(nóng)醫(yī)發(fā)[2010]33號)規(guī)定引進豬只。建立專門隔離

飼養(yǎng)舍，嚴(yán)格檢疫引進豬只。在種豬啟運前對擬引進豬只逐頭進行檢測，確定歐洲型豬藍耳病病毒核酸

檢測陰性后方可啟運引進，引進后隔離飼養(yǎng)45～60天，再經(jīng)檢測合格后方可混群飼養(yǎng)。

7.2病死豬的檢測

7.2.1收集病死豬及母豬所生產(chǎn)的弱仔、死胎、流產(chǎn)胎兒，進行歐洲型豬藍耳病病毒核酸檢測，檢測

方法按4.2執(zhí)行，若病毒核酸檢測出現(xiàn)陽性，應(yīng)重新對種豬場開展凈化。

7.2.2若弱仔、死胎及流產(chǎn)胎兒按4.2方法檢測病毒核酸，檢測結(jié)果陽性者，淘汰對應(yīng)的親本母豬，

并重新對種豬場開展凈化。

7.3人員和車輛等物品的消毒

4

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控制人員出入，豬場門口和各豬舍門口應(yīng)設(shè)立消毒池，定期更換消毒藥水；進入豬場的車輛除過消

毒池消毒外，還應(yīng)對車身進行噴灑消毒；飼養(yǎng)、管理等人員可采取淋浴、消毒液洗手、紫外線照射衣物

等方式消毒；衣、帽、鞋等可能被污染的物品，可采取浸泡、高壓滅菌等方式消毒；一線飼養(yǎng)人員嚴(yán)禁

串舍，生產(chǎn)工具不得混用。

7.4場內(nèi)及舍內(nèi)環(huán)境的消毒

場內(nèi)應(yīng)設(shè)置凈道和污道，對場內(nèi)道路和明溝可用2%的氫氧化鈉等堿性消毒劑消毒；豬舍在有豬的狀

態(tài)下，要選用無刺激或刺激性小的消毒藥進行舍內(nèi)環(huán)境消毒，平時預(yù)防一般1周消毒1～2次。

7.5無害化處理措施

病死豬及母豬所生產(chǎn)的死胎、流產(chǎn)胎兒按GB16548的要求，糞便按NY/T1168的要求進行無害化處

理。

7.6殺蟲防蠅滅鼠措施

采用物理法（機械法）和藥物法定期開展殺蟲、滅鼠、防蠅工作。

5

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

A.1１%溴化乙錠（EB）溶液

溴化乙錠0.2g

滅菌雙蒸水加至20mL

A.2電泳緩沖液（50倍）

A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）

二水乙二銨四乙酸二鈉（分析純）18.61g

滅菌雙蒸水80mL

氫氧化鈉調(diào)pH至8.0

滅菌雙蒸水加至100mL

A.2.2TAE(三羥甲基氨基甲烷－乙酸)電泳緩沖液（50倍）

羥基甲基氨基甲烷（Tris）（分析純）242g

冰乙酸57.1mL

0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）100mL

滅菌雙蒸水加至1000mL

用時用滅菌雙蒸水稀釋使用。

A.31%瓊脂糖凝膠

瓊脂糖（電泳級）2g

TAE電泳緩沖液4mL

滅菌雙蒸水196mL

微波爐中完全融化，加溴化乙錠（EB）溶液20μL。

A.475%乙醇

無水乙醇（分析純）750mL

滅菌DEPC水250mL

A.5滅菌DEPC水

雙蒸水1000mL

DEPC1mL

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用磁力攪拌器室溫下持續(xù)攪拌過夜，分瓶包裝后121℃高壓滅菌25min。

A.6上樣緩沖液

溴酚藍0.2g，加雙蒸水10mL過夜溶解，50g蔗糖加入50mL水溶解后，移入已溶解的溴酚藍溶液中，

搖勻定容至100mL。

A.7電泳緩沖液（1倍）

電泳緩沖液（50倍）10mL

滅菌雙蒸水490mL

A.8磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH7.4，PBS）

氯化鈉（NaCl）8.0g

氯化鉀（KCl）0.2g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）2.9g

磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g

將上列試劑按次序加入定量容器中，加適量蒸餾水溶解后，再定容至1000mL，調(diào)pH至7.4，高壓消

毒滅菌112kPa20min，4℃冰箱保存。

A.9阿氏液

葡萄糖2.05g

檸檬酸鈉0.8g

檸檬酸0.055g

氯化鈉0.42g

加蒸餾水至100mL，溶解后調(diào)pH值至6.1，69kPa15min高壓滅菌，4℃冰箱保存。

_________________________________

7

DB21/T3094—2018

目次

前言............................................................................II

1范圍..............................................................................1

2規(guī)范性引用文件....................................................................1

3術(shù)語和定義........................................................................1

3.1歐洲型豬藍耳病................................................................1

3.2可疑感染豬群..................................................................1

3.3假定健康豬群..................................................................1

4凈化群的建立......................................................................1

4.1采樣數(shù)量和采樣時間............................................................1

4.2檢測方法......................................................................2

4.3處理..........................................................................3

5凈化群的維持......................................................................4

5.1日常檢測......................................................................4

5.2后備豬的檢測..................................................................4

5.3引進豬只的檢疫................................................................4

5.4病死豬的檢測..................................................................4

6凈化場的認定......................................................................4

7凈化場的維持......................................................................4

7.1引進豬只的檢疫................................................................4

7.2病死豬的檢測..................................................................4

7.3人員和車輛等物品的消毒........................................................4

7.4場內(nèi)及舍內(nèi)環(huán)境的消毒..........................................................5

7.5無害化處理措施................................................................5

7.6殺蟲防蠅滅鼠措施..............................................................5

附錄A（規(guī)范性附錄）附錄A..........................................................6

I

DB21/T3094—2018

目次

前言............................................................................II

1范圍..............................................................................1

2規(guī)范性引用文件....................................................................1

3術(shù)語和定義........................................................................1

3.1歐洲型豬藍耳病................................................................1

3.2可疑感染豬群..................................................................1

3.3假定健康豬群..................................................................1

4凈化群的建立......................................................................1

4.1采樣數(shù)量和采樣時間......................