目的探討長鏈非編碼RNA（longnoncodingRNA,lncRNA）KCNQ1OT1在人白色脂肪前體細胞分化過程中的表達情況，以及在肥胖人群脂肪組織中的表達變化，明確KCNQ1OT1與肥胖的相關性，為闡明KCNQ1OT1在人脂肪細胞分化過程及肥胖中的潛在作用提供線索。方法通過實時定量PCR技術，檢測KCNQ1OT1在兩種內(nèi)參基因（PPIA/GAPDH）標準化條件下，于人白色脂肪細胞分化第0，1，3，5，9，12天的表達水平；應用實時定量PCR技術檢測KCNQ1OT1在肥胖和正常人群白色脂肪組織中的表達變化；采用Pearson相關分析探討KCNQ1OT1與人群體質(zhì)指數(shù)（BodymassIndex,BMI）、血清甘油三酯（Triglyceride，TG）及膽固醇(Cholesterol，CHOL)的相關性。結(jié)果1KCNQ1OT1在脂肪細胞分化第1、3、5、9和12天的表達量分別為6.36E-05±0.00、1.88E-03±0.00、1.13E-03±0.00、4.91E-04±0.00、3.50E-04±0.00（PPIA）；3.94E-05±0.00、8.61E-04±0.00、8.61E-04±0.00、9.96E-04±0.00、3.12E-04±0.00、3.12E-04±0.00（GAPDH），與第0天相較，均呈上升趨勢，且變化差異有顯著性（p<0.05）,在分化前期（第1天、第3天）增長尤為明顯。2.KCNQ1OT1在肥胖人群內(nèi)臟脂肪組織中的表達量為3.37E-03±0.002（PPIA）/3.37E-03±0.002(GAPDH),較正常人顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；3.KCNQ1OT1與人群BMI呈正相關，相關系數(shù)為r=0.656（PPIA）和r=0.554（GAPDH），（P<0.05）。KCNQ1OT1與人血清甘油三酯呈正相關，相關系數(shù)為r=0.578（PPIA）和r=0.627（GAPDH），（P<0.05）。結(jié)論1、KCNQ1OT1在白色脂肪細胞分化過程中呈增高趨勢；2、KCNQ1OT1在肥胖人群脂肪組織中的表達增高；3、KCNQ1OT1與BMI、血清TG等肥胖相關指標呈正相關。提示其在人脂肪細胞分化過程中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用以及作為肥胖防治的潛在靶標。析將收集的臨床樣本分為兩組，即正常組(n=8)和超重肥胖組(n=14)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1在超重肥胖組脂肪組織中的表達量顯著高于正常組（p<0.05）其表達水平與BMI成正相關，相關系數(shù)分別為r=0.656（PPIA）和r=0.554（GADPH），p<0.05(圖4)，KCNQ1OT1表達水平與血清TG水平呈正相關，相關系數(shù)分別為r=0.578（PPIA）和r=0.627（GADPH），p<0.05(圖5),與血清CHOL水平的相關性分析顯示：以PPIA為內(nèi)參的表達量呈正相關r=0.557，p<0.05；以GADPH為內(nèi)參的表達量無相關性，r=0.367，p>0.05。3、不同內(nèi)參基因下，KCNQ1OT1表達量與BMI、血清TG、CHOL的相關性分2.KCNQ1OT1在肥胖人群白色脂肪組織中的表達情況將收集的樣本分為兩組：正常組（n=8），超重/肥胖組（n=14）。提取兩組人群白色脂肪組織中的總RNA，并經(jīng)實時定量PCR檢測其中KCNQ1OT1的表達。KCNQ1OT1在正常組人群中的表達水平（2-?CT）為8.20E-03±0.003（PPIA）和1.90E-02±0.007（GAPDH），在肥胖超重人群中表達量的表達量分別為3.37E-03±0.002（PPIA）、3.37E-03±0.002（GAPDH），兩組人群白色脂肪組織中KCNQ1OT1的表達量有顯著性差異。詳見表2和圖3。結(jié)果1KCNQ1OT1在脂肪組織細胞分化不同時間點的表達量KCNQ1OT1在脂肪細胞分化第0天的表達量（2-?CT）為6.36E-05（內(nèi)參基因為人PPIA）和3.94E-05（內(nèi)參為人GAPDH），第1、3、5、9和12天的表達量均呈現(xiàn)上升趨勢（與d0天相比），特別是分化前期（第1天、第3天）增長趨勢更為明顯，差異有顯著性（P<0.05）。于分化第4天加入誘導劑Ⅱ，分化第5、9和12天，KCNQ1OT1的表達量與分化第1和3天相比，略有下降。（詳見表1和圖1、2）1.3.5定量PCR參照PowerUp?SYBR?GreenMasterMixPCR試劑盒說明，以上述逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進行KCNQ1OT1的qPCR擴增。采用2-?CT法計算，以人PPIA和GAPDH基因作為內(nèi)參，計算KCNQ1OT1的相對表達量。1.4統(tǒng)計學方法運用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±SD)表示，計量資料用t檢驗、分化不同時間點表達量的總比較用ANOVA方差分析，；采用Pearson分析法對KCNQ1OT1表達量（2-?CT）與BMI、血清甘油三酯和膽固醇水平進行相關性分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。肥胖是指體內(nèi)脂肪組織過度沉積、達到損害健康的一種疾病狀態(tài)，目前已經(jīng)成為全球流行性最廣的慢性非傳染性疾病之一[1-3]。肥胖不僅表現(xiàn)為體重超標，通常還伴有胰島素抵抗[4]，肥胖是與２型糖尿病、高血壓、血脂代謝異常等有密切聯(lián)系，嚴重影響人體健康[5]。長鏈非編碼RNA（longnoncodingRNA,lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt、不參與編碼蛋白的RNA分子[4]，在多種生理病理過程中扮演多種角色，其中在細胞增值、分化、凋亡過程中所發(fā)揮的作用ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[4]。lncRNAKCNQ1OT1為位于人類染色體11p15.5[5]，目前KCNQ1OT1的研究多集中在腫瘤方面，其水平在多種上皮細胞腫瘤、腺癌中呈上調(diào)趨勢，并有介導腫瘤惡變傾向的作用[6]，另有研究發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1可致機體對紫杉醇等抗癌藥物的抗藥性增加[7]。在大鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1在高糖刺激下，可以加速心肌組織纖維化，進一步提示糖脂代謝異常會改變該lncRNA表達，進而參與疾病的發(fā)生[8]，目前KCNQ1OT1與肥胖的相關研究未見報道，因此，KCNQ1OT1是否在肥胖過程中發(fā)揮作用引起了我們的關注。本研究以人白色脂肪前體細胞為模型，分析了KCNQ1OT1在脂肪前體細胞分化過程的水平變化，初步明確了KCNQ1OT1在肥胖人群中的表達情況、并分析了其與BMI、血清甘油三酯及膽固醇的相關性，為進一步探討KCNQ1OT1在人脂肪細胞分化及肥胖中的作用與機制提供線索。1、１材料與方法1.1樣本內(nèi)臟脂肪組織取自江蘇省人民醫(yī)院、南京市婦幼保健院的就診患者共28名。組織經(jīng)生理鹽水沖洗，RNAlaterer?RNA穩(wěn)定試劑處理后，-80℃保存，排除嚴重心肺功能障礙、肝腎等疾病患者。分組：按照2003年中國肥胖工作組制定的《中國成人超重和肥胖癥預防和控制指南》[8]建議，將BMI指數(shù)大于24kg／m2納入超重、肥胖組/BMI指數(shù)介于18kg／m2和24kg／m2之間納入正常對照組。最終納入統(tǒng)計的病例共22例，其中：正常對照組8例；肥胖組中肥胖/超重14例，所有研究工作均經(jīng)南京醫(yī)科大學附屬南京市婦幼保健院倫理審查委員會批準（倫理號：寧婦倫字（2010）36號）），并簽署知情同意書。1.2細胞及實驗材料人前體脂肪細胞（Humanpreadipocytefromvisceralfat,HPA-v）（Sciencell公司美國）；DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素（Penicillin-StreptomycinSolution,P/S）（Gibco公司美國）；=1\*ROMANI型膠原酶、胰島素(Insulin)、地塞米松（DEX）、3-丁基-1-甲基次黃嘌呤（IBMX）(Sigma公司美國)；PBS緩沖液(維森特中國)；RNeasymini試劑盒(QIAGEN德國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser,TARAKA,Japan)；PCR試劑盒（PowerUp?SYBR?GreenMasterMix，賽默飛公司美國）；定量PCR儀(BiosystemsViiA7,lifetechnologies,美國)。1.3方法1.3.1人前體脂肪細胞（HPA-v）的培養(yǎng)將人前體脂肪細胞(HPA-v)按105/ml密度接種于6孔板，加入含5%胎牛血清、PAM完全培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.3.2脂肪細胞的誘導分化待細胞長滿培養(yǎng)基（誘導第0天）后，將PAM完全培養(yǎng)液換成誘導劑Ⅰ培養(yǎng)基（DMEM+1%青鏈霉素+0.5mmol/LIBMX+1umol/L地塞米松+5ug/ml胰島素），第四天后換成誘導劑Ⅱ（DMEM+1%青鏈霉素+5ug/ml胰島素）直至分化成熟。收集d0、d1、d3、d5、d9、d12的細胞樣品。1.3.3總RNA抽提及cDNA逆轉(zhuǎn)錄按TianGen試劑盒說明書步驟提取細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄1.3.4引物設計通過加州大學基因數(shù)據(jù)庫（UCSC），生物信息學數(shù)據(jù)庫（Ensembl），RefSeq等數(shù)據(jù)庫查找KCNQ1OT1，PPIA，GAPDH等基因的正確序列，選擇人PPIA和GAPDH作為內(nèi)參。利用Primerblast(/tools/primer-blast)在線設計引物并驗證特異性，最后送銳真生物技術公司合成，引物序列如表：討論脂肪前體細胞分化是肥胖研究的重要方向ADDINNE.Ref.{62804D16-EE46-4101-8C9E-D433E0449B60}[10]。肥胖是一種病理狀態(tài)，由于能量代謝失衡導致體內(nèi)脂肪細胞增多，脂肪細胞數(shù)量的增多是由脂肪前體細胞分化增加所致。前脂肪細胞與分化成熟的脂肪細胞相比，有近百個lncRNAs的差異表達，在對這些lncRNAs進行干擾后發(fā)現(xiàn)，脂肪細胞成熟標記物表達水平也隨之發(fā)生了相應改變[14]，說明這些lncRNAs的表達水平可能和脂肪細胞的成熟過程密切相關。以往研究發(fā)現(xiàn)，有多個處于活躍狀態(tài)的lncRNAs在脂肪細胞的分化中起到非常重要的作用[3]，如SPA、U90926，和Gm15441等lncRNAs[11-13]。除此之外，lncRNA-MIR31HG,HOXA11-AS1,lncRNA-ADINR，lncRNA-paral1和lncRNA-NEAT1等基因?qū)χ厩绑w細胞分化也起到一定的作用[15-19]。以上研究說明：lncRNAs可能是脂肪細胞分化過程的關鍵調(diào)控因子，可為肥胖的深入研究提供線索。本研究采用RealtimePCR技術對小鼠脂肪前體細胞中KCNQ1OT1的表達量進行檢測，我們發(fā)現(xiàn)，在脂肪前體細胞分化過程中，尤其在加入誘導劑I（分化早期）后，KCNQ1OT1水平顯著增加，加入誘導劑II后較之分化早期略有下降，就提示KCNQ1OT1有可能參與了脂肪細胞的早期分化。本研究對肥胖人群白色脂肪組織中KCNQ1OT1的含量進行檢測，其水平顯著高于正常人，且與BMI呈正相關，與血清脂類物質(zhì)（TG、CHOL）水平呈正相關。而脂肪在體內(nèi)代謝的生化過程主要分為甘油三酯、磷脂、膽固醇和脂蛋白等四類物質(zhì)的代謝，我們的研究證實，人白色脂肪組織中KCNQ1OT1水平與脂代謝密切相關。因此，我們認為KCNQ1OT1在肥胖過程中發(fā)揮重要的作用，提示，KCNQ1OT1可作為肥胖發(fā)生和脂代謝的重要調(diào)控因子做進一步研究，今后將通過功能實驗來進一步驗證。本研究中，肥胖人群KCNQ1OT1的表達呈上升趨勢，且與脂類物質(zhì)水平呈正相關。本人前期研究中發(fā)現(xiàn)TG和TC兩種脂質(zhì)物質(zhì)水平和OGTT試驗結(jié)果呈一定程度正相關，脂質(zhì)物質(zhì)代謝紊亂可導致機體呈現(xiàn)一定程度的胰島素抵抗[14]。FanYang等人的研究證實，在30mmol/L血糖作用下，人心肌纖維組織中KCNQ1OT1被大量激活，通過沉默糖尿病大鼠模型的KCNQ1OT1基因，可顯著改善病鼠心功能和心臟纖維化的程度，這也提示KCNQ1OT1水平可能與糖脂代謝、胰島素抵抗之間存在某種關聯(lián)。在胰島素抵抗狀態(tài)下，組織對血漿葡萄糖利用減少，刺激胰島Beta細胞釋放胰島素，繼而導致高胰島素血癥。高胰島素血癥