附件3急性吸入毒性試驗方法AcuteInhalationToxicityStudy1范圍本規(guī)范規(guī)定了動物急性吸入毒性試驗的基本原則、要求和方法。本規(guī)范適用于化妝品單一成分的原料安全性毒理學檢測。2試驗目的急性吸入毒性試驗可評價化妝品原料能否被直接吸入或者通過其他途徑進入呼吸道所產生的毒性反應，可對受試物進行毒性分級，為亞急性毒性和其他毒理學研究中染毒濃度選擇提供依據(jù)。3定義3.1急性吸入毒性acuteinhalationtoxicity實驗動物短時間（24h內）持續(xù)吸入一種可吸入性受試物后，在短期內出現(xiàn)的健康損害效應。3.2半數(shù)致死濃度（LC50）medianlethalconcentration在一定時間內經呼吸道吸入受試物后，引起實驗動物總體中半數(shù)死亡的毒物的統(tǒng)計學劑量，以單位體積空氣中受試物的質量（mg/m3）來表示。3.3空氣動力學直徑aerodynamicequivalentdiameter(AD)氣溶膠顆粒與不同直徑標準單位密度（1.0g/cm3）球形顆粒中某一顆粒的終端沉降速度相同時，該標準球形顆粒的直徑即為空氣動力學直徑。其計量單位為μm。3.4質量中值空氣動力學直徑massmedianaerodynamicdiameter(MMAD)氣溶膠中小于和等于某一空氣動力學直徑的顆?？傎|量，占全部顆粒物質量50%時，該直徑即為空氣動力學質量中位數(shù)直徑。3.5幾何標準差geometricstandarddeviation(GSD)用以描述氣溶膠顆粒大小的分布狀態(tài)。以撞擊器各級累積百分比為Y軸、粒徑為X軸擬合對數(shù)概率曲線，以累積百分比84.1%對應的粒徑除以累積百分比50%的粒徑，即為幾何標準差。4試驗的基本原則受試物通過吸入暴露裝置制備成不同濃度的樣品，各試驗組動物在一定時間內吸入不同濃度的受試物，暴露濃度的選擇可通過預試驗確定，吸入暴露后觀察動物的毒性反應和死亡情況，試驗期間死亡的動物要進行尸檢，試驗結束時存活的動物要處死進行大體解剖。5試驗方法5.1受試物試驗前受試物的有用信息包括：受試物的特性（如純度），化學結構和理化性質；任何體外或者體內性試驗結果：預期用途和人體暴露的可能性；得到的結構類似物的構效關系數(shù)據(jù)和毒理數(shù)據(jù)，在研究中，盡可能使用一組受試物，而且其樣本應該在能保持其純度、穩(wěn)定性的條件下保存。受試物的準備：可對受試物進行適當處理，使其達到適當濃度和粒徑。如果是顆粒材料可經過機械加工，以達到所需的粒度分布，但不要分解或者改變供試品，如果在機械過程中已經被認為改變了物品組分時，應對受試物成分進行驗證，驗證如果不產生可吸入顆粒，則不需要進行吸入毒性試驗，否則應進行吸入毒性試驗。5.2實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境常規(guī)選擇嚙齒類動物，首選大鼠，一般選用8~12周齡的大鼠，使用雌性動物應是未孕和未曾產仔的。如需使用其他品系需說明理由。試驗開始時動物體重的差異應不超過平均體重的±20%。試驗前動物要在實驗動物房環(huán)境中至少適應3~5d時間。染毒前，動物應提前適應口鼻暴露時所用的固定器，以減少進入新環(huán)境引起的不適。實驗動物及實驗動物房應符合國家相應規(guī)定。選用標準配合飼料，飲水不限制。5.3染毒濃度在試驗開始前，通常要進行預試驗，為主試驗的濃度選擇提供幫助，受試物已知或預期有毒則進行限度試驗。用全球化學品統(tǒng)一分類和標簽系統(tǒng)（GHS）的分類系統(tǒng)，氣體、蒸氣、溶膠的限定濃度分別為20000ppm、20mg/L和5mg/L。傳統(tǒng)LC50試驗至少設置3個不同濃度的染毒組，每組動物一般為10只，雌雄各半。各劑量組間距大小以兼顧產生毒性大小和死亡為宜，通常以較大組距和較少量動物進行預試，以便能在各濃度組的試驗動物中發(fā)生一定程度毒效應和死亡。所得資料應足以繪制出濃度－死亡曲線，并在可能情況下求出LC50值。5.4暴露方式根據(jù)受試物的性質和試驗目的來選擇吸入染毒方式，首選的暴露方式為口鼻式暴露，特別是在研究液體或固體氣溶膠或者可凝結成為氣溶膠的蒸氣時。對于特殊的研究目的，也可采用全身暴露染毒裝置以更好地滿足研究需求，但應在試驗報告中予以闡釋說明。采用全身暴露染毒時應保證染毒柜中氣流的穩(wěn)定性，試驗動物的總體積不能超過染毒柜容積的5%。5.5暴露條件口鼻式暴露時間推薦為4h，暴露期間應禁食，在全身暴露時可以提供水。如果需更長時間的研究，應提供理由。5.6方法5.6.1傳統(tǒng)的LC50法在傳統(tǒng)法中，暴露時間為4h。動物暴露在一個限定濃度（限度試驗），或在至少3個不同的濃度下（主試驗）。除已知受試物信息外，在開展主試驗前，需要進行預試驗。預試驗：預試驗可用來估計受試物的毒性效應，確定易感性的性別差異，并為限度試驗或主試驗的濃度選擇提供幫助。在選擇預試驗的濃度水平時，應該充分使用所有可得的信息，比如現(xiàn)有的定量－構效關系（Q）SAR數(shù)據(jù)和類似化學品的數(shù)據(jù)。試驗中，每個濃度水平的每種性別的試驗動物不超過3只，通常只有一個濃度水平。已經進行過的急性吸入毒性試驗－急性毒性分類法研究可以用來替代預試驗。限度試驗：當受試物已知或預期基本無毒時，可采用限度試驗。受試物的毒性作用信息，可以來源于已測試過的類似化合物或混合物或產品的特性和具有毒理意義的組成成分。在限度試驗中，雌雄各3只動物暴露在限定濃度中。如果在限定濃度發(fā)現(xiàn)動物死亡或瀕死，則限度試驗的結果可作為其他濃度試驗（如主試驗）的預試驗。如果受試物的理化性質決定其不可能達到限定濃度，則需測試其最大可及濃度。如果最大可及濃度的死亡率小于50%，則不需進行進一步試驗。主試驗：進行主試驗時，一般每個濃度組有10只動物，雌雄各半（或5只易感性別的動物），且至少有3個濃度水平。必須有足夠多的濃度水平足以繪制出濃度死亡曲線，并在可能情況下求出LC50各暴露組之間的時間間隔取決于中毒體征的出現(xiàn)、持續(xù)時間與嚴重程度。是否需要對下濃度水平進行試驗，取決于先前的試驗動物是否能夠成活。5.6.2濃度－時間法濃度－時間法是傳統(tǒng)LC50法的另一種替代方法。這種方法使試驗動物暴露在不同濃度的受試物水平，而且暴露時間也不同。所有的試驗都采用口鼻部吸入的方法。與傳統(tǒng)法相比，濃度－時間法得到的LC01與LC100的值更加穩(wěn)定。當在4個濃度水平和5種暴露持續(xù)時間的主試驗采用濃度－時間法時，每個濃度－時間間隔只需使用2只動物（雌雄各半或易受影響的單一性別）。在某些情況下，在每濃度－時間間隔，可以選擇兩種性別的動物各2只，這能減少參數(shù)估計的誤差和變異性，增加成功率，提高置信區(qū)間的覆蓋范圍。當用來參數(shù)估計的數(shù)據(jù)擬合不好時，可能需要第5個濃度水平。預試驗：預試驗一般用各性別、各濃度3只動物，它可以為主試驗選擇1個合適的初始濃度和最大化減少動物使用。暴露時間為4h。如果能從急性吸入毒性試驗－急性毒性分類法中得到死亡數(shù)據(jù)，那么可以不進行預試驗。在選擇研究中的初始目標濃度時，應該考慮在急性吸入毒性試驗－急性毒性分類法中觀察到的各性別和各個濃度的死亡率。主試驗：初始濃度（第一步暴露）可能是限定濃度，也可根據(jù)預試驗選擇濃度。每組雌雄各1只動物暴露于此濃度下，持續(xù)時間不同（如15、30、60、120、240min），總共用到10只動物。限定濃度可根據(jù)監(jiān)管要求選擇，氣體、蒸氣、氣溶膠的限定濃度分別為20000ppm、20mg/L、5mg/L（或為最大可及濃度），如果在第一步暴露中發(fā)現(xiàn)死亡，則引起死亡的最小暴露濃度將為下一步試驗的濃度建立提供指導，每一個后續(xù)的試驗都將取決于先前的試驗結果。當供試品物理或化學性質無法達到極限濃度時，應測試可達到的最大濃度。如果在可達到的最大濃度下，致死率低于50%，則不需要進行下一步的測試，如果不能達到極限濃度，研究報告應提供說明和數(shù)據(jù)支持，如果可達到的最大蒸汽濃度不會引起毒性，則可能需要將供試品作為液體氣溶膠產生。對于很多受試物，如果暴露時間間隔適當，在初始濃度得到的結果與在其他3個濃度組得到的結果，就能足以繪制濃度－時間－死亡曲線。5.7暴露條件的監(jiān)測5.7.1濃度監(jiān)測試驗期間為保證實際濃度的穩(wěn)定性，可以使用實時監(jiān)測設備（如氣溶膠光度計），或定期通過特異性的方法（如采用撞擊器吸附或化學反應的原理直接采樣，然后進行化學分析），或非特異性的方法如濾膜采樣法來測定呼吸區(qū)或染毒柜內氣溶膠濃度，以保證暴露條件的穩(wěn)定性。對于氣體和蒸汽，單個腔室濃度樣品的平均濃度不得超過±10%，對于液體或固體氣溶膠，平均濃度不應超過±20%，應計算和記錄腔室的平衡時間（t95）。5.7.2粒徑監(jiān)測在發(fā)生系統(tǒng)中，應進行粒度分析，以確保氣溶膠濃度的穩(wěn)定性。推薦可吸入質量中值空氣動力學直徑（MMAD）應該在1~4μm，幾何標準差（σ）在1.5~3.0。在染毒期間，需經常進行粒度分析，以測定粒度分布的一致性。如達不到要求，應說明理由。氣溶膠粒徑的測定需在染毒4小時內至少采樣2次，可采用級聯(lián)撞擊采樣器或其他設備如氣體動力學粒徑儀等，粒徑分析所得質量濃度應處于由濾膜分析法所得質量濃度的合理的限度范圍內。5.7.3暴露系統(tǒng)內環(huán)境監(jiān)測染毒裝置內氣流：染毒裝置應配備動態(tài)氣流，口鼻吸入染毒過程中應使裝置內保持輕度負壓，全身暴露裝置染毒柜內應密閉，以防止受試物泄露到外部環(huán)境中。暴露期間盡可能連續(xù)監(jiān)測并每小時記錄1次，在暴露系統(tǒng)中，氧氣濃度應至少為19%，二氧化碳濃度不得超過1%，如果達不到要求，應定期監(jiān)測氧氣和二氧化碳濃度。染毒裝置內溫度保持在22±3℃，口鼻暴露和全身暴露都需監(jiān)測記錄動物呼吸區(qū)的相對濕度，試驗期間應至少監(jiān)測和記錄三次，較短時間內每半小時測一次。理想的相對濕度一般在30%～70%，但在某些情況下，可能無法達到（例如在測試水溶液型受試物時），應在試驗報告中予以闡釋說明。5.8臨床觀察在暴露剛開始當天至少進行兩次臨床觀察，或者根據(jù)動物反應，進行更頻繁觀察。觀察期限最少為14d，以后每天至少進行一次觀察。中毒體征出現(xiàn)和消失的時間都十分重要，特別是在有中毒體征延遲趨勢時。動物瀕死、疼痛劇烈與嚴重且持久的痛苦皆應予以安樂死。當動物被安樂死，或者發(fā)現(xiàn)死亡時，應該盡可能準確記錄死亡時間。所有的觀察應該被系統(tǒng)地記錄，每個動物應該保持單獨記錄。觀察內容應該包括皮毛，眼睛和黏膜，呼吸，循環(huán)，自主和中樞神經系統(tǒng)，肢體活動和行為的改變。應該記錄可能的局部和全身反應的差別。要注意有無震顫、驚厥、流涎、腹瀉、昏睡、睡眠和昏迷癥狀。測試直腸溫度可為出現(xiàn)反射性呼吸遲緩、C-纖維刺激反射或與給藥方式或封閉相關的低溫/高熱情況提供佐證。每只動物體重應該在暴露前一天到暴露（day0），并且至少在第1天、第3天和第7天（以及此后每周），以及在第1天后的死亡或安樂死時進行記錄。若動物體重出現(xiàn)≥20%的持續(xù)遞減，應該進行密切監(jiān)測。在暴露結束后，應測量存活動物的體重，并實施安樂死。5.9病理檢查所有實驗的動物，包括在實驗中死亡的，或者出于動物福利原因被安樂死以及從試驗中撤離的，應該進行大體解剖。如果動物被發(fā)現(xiàn)死亡后，應盡可能快地進行尸體解剖，通常在1~2d內，如不能被立即進行尸體解剖，動物應該被冷藏，以盡量減少自溶。記錄每個動物的大體病理變化，并特別注意呼吸道改變。其他附加檢查可為研究提供更為深入的解釋價值，例如測量存活大鼠肺的重量，和/或提供呼吸道刺激性的顯微鏡檢查證據(jù)，對死亡和存活24h及24h以上的動物中存在大體病理改變的器官進行組織病理學檢查。如受試物對水有反應（如酸和吸濕性受試物），可開展整個呼吸道的顯微鏡檢查。5.10LC50的計算一般可采用多種方法測定LC50，建議采用一次最大限度試驗法、霍恩氏法、概率單位－對數(shù)圖解法和寇氏法等。5.11試驗結果評價5.11.1結果處理應該提供每只動物的體重和尸檢發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)。臨床觀察數(shù)據(jù)應該以表格的形式呈現(xiàn)，統(tǒng)計出各實驗組使用的動物的數(shù)量，出現(xiàn)特殊中毒特征的動物數(shù)量，實驗中死亡或者人道處死的動物數(shù)量，動物個體的死亡時間，毒副作用的描述和時間進程，可逆體征以及尸檢發(fā)現(xiàn)。5.11.2結果評價評價試驗結果時，應將LC50與觀察到的毒性效應和尸檢結果相結合考慮，LC50值是受試物急性毒性分級及判定受試物經呼吸道吸入后引起動物死亡可能性大小的依據(jù)，引用LC50值時一定要注明所用實驗動物的種屬、性別、暴露方式及時間長短、觀察期限等。評價應包括受試物吸入暴露劑量與動物異常表現(xiàn)（包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應及其他毒性作用）的發(fā)生率和嚴重程度之間的關系。毒性分級見表1。表1吸入毒性分級分級氣體（ppm）蒸氣（mg/L，4h）粉塵和霧（mg/L，4h）第1類LC50≤100LC50≤0.5LC50≤0.05第2類100＜LC50≤5000.5＜LC50≤2.00.05＜LC50≤0.5第3類500＜LC50≤25002.0＜LC50≤100.5＜LC50≤1.0第4類2500＜LC50≤2000010＜LC50≤201.0＜LC50≤5第5類＞20000＞20＞5注：分類標準引用《全球化學品統(tǒng)一分類和標簽制度》(GHS)。第5類的標準旨在