2《食用油中黃曲霉毒素B1的測定時間分辨熒光免疫層析法》編制說明主編單位和參編單位、人員及分工等。黃曲霉毒素B1是由黃曲霉和寄生曲霉等菌株產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物，具有致植物油加工店花生油黃曲霉毒素B1超標(biāo)；2019年，國家市場監(jiān)管總局抽查出“熊八妹-串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸篩查法與放射免疫法等。薄層色譜法曾是使用最廣泛的分析方法，但是由于操作步驟繁瑣，毒性大，現(xiàn)在已經(jīng)很少使用。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜3制定《食用油中黃曲霉毒素B1的測定從上世紀(jì)90年代，我國逐漸建立了多種食用油黃曲霉毒素測定技術(shù)，這些技術(shù)為能適應(yīng)中國食用油現(xiàn)代化安全生產(chǎn)準(zhǔn)確度高、操作簡單的測定要求。我國相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有法都需要大型儀器，無法滿足現(xiàn)場快速檢測需求；LS/T6122-2017《糧油檢驗糧油及制品中黃曲霉毒素含量測定柱后光化學(xué)衍生高效液相色譜法》需要高效液相色譜儀成前期工作，提案和立項。2023年5月-2023年12月，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物4李培武，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，研究華權(quán)高，武漢華美維士康生物工程有限公司，董二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容(如技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)公式、性能、要求、5試樣中黃曲霉毒素B1與銪乳膠標(biāo)記的特異2前處理條件的優(yōu)化表1食用植物油取樣量對樣品檢測結(jié)樣品取樣量檢測結(jié)果，μg/kg平均值μg/kgRSD%12345花生油0.239.0027.0022.0520.8525.6231.330.528.5030.1520.5525.2027.4526.3725.3521.1520.2521.1523.7022.329.532.023.8521.0022.9521.369.315.020.409.28大豆油0.26.469.078.949.348.970.58.029.809.619.349.609.569.849.309.336.272.09.359.968.535.09.359.76菜籽油0.25.605.058.205.804.755.8823.180.54.305.456.404.805.655.326.455.906.205.455.705.946.672.04.995.575.685.686.265.648.015.05.805.685.344.936.095.578.022.2提取溶劑選擇和用量6主要是與裝有反向離子交換吸附劑的多功能凈化柱聯(lián)用；考慮到檢測方法的適用性和與相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果的可比性，選樣品80%乙醇溶液用量0.4mL0.6mL2.0mL3.0mL含量μg/kgRSD%含量μg/kgRSD%含量μg/kgRSD%含量μg/kgRSD%含量μg/kgRSD%花生油24.121.88.222.521.57.9大豆油6.520.18.99.88.68.08.2菜籽油3.222.74.85.25.49.45.39.5從表4可看出，提取花生油、大豆油和菜籽油樣品，隨著乙醇溶液用量增大，提取越完全，乙醇溶液超過1.0mL后檢測結(jié)果無顯著差異，考慮綠色環(huán)保及節(jié)約試劑，因此，選擇1.0mL的80%乙醇溶液作為提取溶劑。2.3提取方式、時間選擇表3不同提取方式、不同提取時間條件下提取效果比較提取方式提取時間樣品（加標(biāo)濃度μg/kg）花生油大豆油菜籽油7旋渦提取方式(測試回收率%)90.495.886.22min86.492.193.15min94.688.593.892.194.820min89.584.994.1振搖提取方式(測試回收率%)85.299.32min92.093.55min93.293.395.486.694.220min88.184.5超聲波提取方式(測試回收率%)75.974.482.22min83.674.283.55min78.284.984.485.395.492.620min92.390.694.13免疫層析反應(yīng)溫度對實驗的影響體反應(yīng)。樣品中的黃曲霉毒B1在與銪標(biāo)記的特應(yīng)的重要因素。抗原抗體反應(yīng)一般在15℃~40℃范圍內(nèi)進行，在此范圍內(nèi)，溫度越高，曲霉毒B1現(xiàn)場篩查檢測技術(shù)，保證反應(yīng)溫度的4免疫層析反應(yīng)時間對實驗的影響8樣品名稱反應(yīng)時間2min3min5min10min含量μg/kgRSD%含量μg/kgRSD%含量μg/kgRSD%含量μg/kgRSD%含量μg/kgRSD%花生油22.222.69.322.18.7大豆油6.68.99.08.88.0菜籽油3.54.85.75.89.25.3纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細(xì)作用，滴加在樣品反應(yīng)瓶中的液體溶解了銪-抗標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和硝酸纖維素（NC）膜檢測線上黃曲霉毒B1-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，使檢測線熒光強度降低，從而樣品中黃曲霉毒素濃度與檢測線X=pVnm9p——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的測定液中黃曲霉毒素含量，單位為納克每毫升的樣本。由低濃度到高濃度進行檢測，根據(jù)檢測線T信號值與質(zhì)控線C信號值的比值（T/C）和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度的自然對數(shù)值（I線的熒光信號強度值/C線的熒光信號強度值（T/C）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：根據(jù)GB/T5009.1－2003（附錄A檢驗方法中技術(shù)參數(shù)和數(shù)據(jù)處理檢出限計LX1s Xi－測定n次空白溶液的平均值（n≥20b－單位標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積響應(yīng)值；標(biāo)準(zhǔn)起草小組分別對花生油、大豆油、菜籽油空白樣品進行了21次重復(fù)實驗，用大豆油、菜籽油的黃曲霉毒素B1進行平行測定實驗，測定結(jié)果見表5。結(jié)果表明兩種樣品免疫親和層析凈化高效液相色譜法μg/kg時間分辨熒光免疫層析法μg/kg時間分辨熒光免疫層析法RSD%絕對差μg/kg花生油22.221.98.50.3大豆油7.60.6菜籽油6.45.67.10.8標(biāo)準(zhǔn)起草小組在同一時間對花生油、大豆油、菜籽油樣品分別進行了11次重復(fù)測μg/kg時，兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%；黃曲霉毒B1含樣品名稱黃曲霉毒素B1含量，μg/kg123456789平均值相對相差%花生油21.822.121.020.320.620.221.520.622.520.321.1大豆油9.59.69.29.89.59.49.09.49.98菜籽油5.45.35.54.85.65.55.25.85.75.75.65.3樣品名稱黃曲霉毒素B1含量，μg/kg2023年09月13日2023年10月20日2023年11月30日平均值相對相差%花生油24.423.125.9大豆油菜籽油5.26.4B1測定的再現(xiàn)性要求。由此確定本標(biāo)準(zhǔn)再現(xiàn)性要求為：在重復(fù)性條件下，黃曲霉毒素B1含量不大于10.0μg/kg時，兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的30%；黃曲霉毒B1含量大于10.0μg/kg時，兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算對4個食用油樣品中黃曲霉毒素B1進行了比對檢測，檢測結(jié)果匯總見表8；對結(jié)果統(tǒng)表8食用油中黃曲霉毒素實驗室間比對檢測結(jié)果單位樣品重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3重復(fù)4重復(fù)5平均值變異系數(shù)%實驗室124.425.023.025.320.223.68.82號油樣9.88.49.67.23號油樣8.74號油樣NDNDNDNDND--實驗室223.323.822.024.222.58.82號油樣9.46.99.78.93號油樣4號油樣NDNDNDNDND--實驗室325.626.224.226.621.624.82號油樣8.97.69.93號油樣8.74號油樣NDNDNDNDND--實驗室425.324.923.824.920.924.07.52號油樣8.77.59.63號油樣7.64號油樣NDNDNDNDND--表9食用油中黃曲霉毒素實驗室間比對檢測結(jié)果統(tǒng)計分析