山東省沂源縣新型布尼亞病毒致發(fā)熱伴血小板減少綜合征流行特征的初步研究目的研究新型布尼亞病毒(SFTSV)所致發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)的流行病學特征,研究SFTS的實驗室診斷方法,探討SFTSV在自然界可能存在的動物宿主及傳播媒介,為發(fā)熱伴血小板減少綜合征的預防和控制提供科學依據。方法1.SFTS病人實驗室診斷、臨床特征及其流行病學特征研究2011年6月至2011年11月,從山東省沂源縣醫(yī)院、中醫(yī)院獲得24例SFTS疑似病人急性期血清,并在3個月后采集其恢復期血清,記錄病人基本資料、臨床信息和實驗室檢查結果。提取疑似病人急性期血清RNA,自行設計三對引物(LCYY/L、MCYY/M、SCYY/S)用巢式RT-PCR方法分別擴增血清中SFTSVRNA的L、M和S片段,將自行設計的三對引物與參考文獻的三對引物(LW/LN、MWMN、SW/SN)的擴增結果進行比較,計算不同引物擴增的檢出率?；蚩寺『筮M行DNA測序,同時ELISA方法檢測病人急性期和恢復期血清SFTSV總抗體。根據國家衛(wèi)生部頒布《發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南(2010版)》的診斷標準,進行SFTS病例確診。研究SFTS確診病人的流行病學特征和臨床特征,以及SFTSVRNA檢出率與病人血清采集時間的關系。2.健康人群血清中SFTSV血清流行病學調查采用問卷方式在山東省沂源縣SFTS發(fā)病率較高的鄉(xiāng)鎮(zhèn)進行流行病學調查,同時采集健康人血清。采用ELISA方法檢測健康人血清中SFTSV總抗體,計算健康人群中SFTSV抗體陽性率。3.羊血清SFTSV抗體、RNA檢測及病毒分離2011年6月在山東省沂源縣SFTS發(fā)病率較高的鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集放養(yǎng)羊血清,ELISA方法檢測羊血清中SFTSV總抗體,計算羊血清中SFTSV抗體陽性率。將抗體檢測陰性的羊血清提取RNA,RT-PCR檢測血清中SFTSVRNA,同時將血清接種DH82細胞,進行SFTSV分離培養(yǎng),盲傳3代后,RT-PCR檢測SFTSVRNA。4.蜱、蜱卵體內SFTSVRNA檢測及病毒分離培養(yǎng)采用布旗法在SFTS流行地區(qū)草地采集游離蜱成蟲和若蟲,采用宿主動物體表逆毛撿拾法,從羊體表采集寄生蜱,按照地區(qū)、數(shù)量各自分裝并進行形態(tài)學分類鑒定；部分吸血蜱帶回實驗室內產卵。提取RNA,RT-PCR檢測蜱及蜱卵中SFTSVRNA;蜱及蜱卵用無菌生理鹽水清洗后,研磨,離心,上清接種DH82細胞,盲傳3代后,RT-PCR檢測SFTSVRNA。5.野鼠體內SFTSVRNA及抗體的檢測2011年6月～2012年11月期間,在野外自然環(huán)境中采用夾(籠)夜法捕捉野鼠。每次獲取死鼠后,鑒定其種屬、性別,解剖取脾臟,潔凈濾紙吸取鼠心臟血。將鼠脾臟在冰上研磨,提取RNA后RT-PCR擴增SFTSVRNA,并進行序列測定,吸血的濾紙用PBS清洗后,ELISA檢測鼠血SFTSV總抗體。結果1.SFTS實驗室診斷24份疑似病例中,12例SFTSVRNA陽性,陽性率為50.0%(12/24),不同引物RT-PCR擴增SFTS病人血清中SFTSVRNA的L,M,S不同片段的檢出率不同,從生物學意義上看,S片段檢出率最高,其次是L片段,未擴出M片段。而且SCYY-F1/R1、S-F2/R2引物擴增的陽性病例包括了其他引物擴增的所有陽性病例,急性期血清中病毒RNA的檢出率,7天內為64.5%,8～14天為37.5%,二者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；13例病人急性期血清SFTSV抗體陽性,陽性率為54.2%(13/24)；21例恢復期血清中,18例SFTSV抗體陽性,陽性率為85.7%(18/21)。根據SFTSVRNA及總抗體檢測結果,確診病人22例,表明發(fā)熱伴血小板減少病例中,91.7%的病例是SFTSV感染。2.SFTS病人臨床特征及其流行病學特征臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱和消化道癥狀,100%病人均有發(fā)熱癥狀,血常規(guī)檢測出現(xiàn)血小板減少和(或)白細胞減少。22例SFTS確診病人發(fā)病時間集中在5月～10月份,8月份達高峰。年齡在40-80歲,男性14名,女性8名,不同年齡組間性別無顯著性差異。職業(yè)均是農民,90.9%確診病人飼養(yǎng)家畜,27.3%確診病人有明確蜱咬史。3.本次調查了237名健康人群,年齡分布在20-89歲,年齡中位數(shù)54歲,男女比例為1：1.6,不同年齡組間性別分布無顯著性差異,職業(yè)均是農民,79.3%飼養(yǎng)家畜,均無明確蜱咬史。237份健康人血清中,2份抗體陽性,SFTSV,總抗體陽性率為0.8%(2/237),效價>1：128。4.188份羊血清中,161份SFTSV抗體陽性,陽性率為85.6%(161/188),血清效價為1：32-1：1024。27份SFTSV抗體陰性羊血清中SFTSV核酸檢測均為陰性,DH82細胞分離培養(yǎng)未分離到SFTSV。5.本次采集蜱均為長角血蜱,草地里共采集游離蜱成蟲450只,未檢測到SFTSVRNA;2000只蜱若蟲SFTSV核酸檢測結果均為陰性。羊體表采集的517只吸血蜱,492只羊吸血蜱中1只核酸檢測陽性,陽性率為0.20%(1/492)。25份吸血蜱產的卵中,SFTSV核酸檢測結果均為陰性,DH82細胞分離培養(yǎng)未分離到SFTSV.6.本研究共獲得93份野鼠,其中：黑線姬鼠59只,倉鼠3只,黃胸鼠17只,褐家鼠11只,3只鼩鼱。鼠脾臟中SFTSV核酸檢測結果均為陰性,鼠血清SFTSV抗體均為陰性。結論1.山東省沂源縣健康人群中存在SFTSV感染。在SFTS流行季節(jié),在SFTS流行地區(qū),臨床上出現(xiàn)發(fā)熱伴血小板減少和(或)白細胞減少病例時要首先考慮SFTSV感染,